联合检测JAK2V617F、MPLW515L/K和CALR基因突变在原发性血小板增多症患者中的意义

穆启明，熊娅玲，姚文娟

(湖北省十堰市人民医院 442000)

原发性血小板增多症(PT)是以Ph染色体阴性为典型病理特征的一类骨髓增殖性疾病(MPN)，临床中最常见的并发症主要包括骨髓纤维化、血栓形成和高出血风险，约10%患者可向急性白血病转化[1]。PT的发病机制可能是遗传和环境共同作用的结果。JAK2V617F突变可发生在50%～60%的PT患者，阳性突变患者有更高的血栓栓塞风险，逆转阳性突变可改善生存结局和降低严重不良事件的发生，提示JAK2V617F突变在PT的发病过程中发挥重要作用[2]。但仍有一半患者表现为JAK2V617F阴性，最近基因测序发现，MPLW515L/K和CALR基因突变可弥补JAK2V617F阴性的不足[3-4]，为阐述PT发病的遗传学机制提供重要依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 连续选择2015年1月至2017年5月在本院门诊以单纯血小板持续升高(≥300×109/L)就诊患者共342例，排除合并白细胞、红细胞和血红蛋白升高或降低，近期手术、出血、输血史，妊娠史，恶性肿瘤患者；明确的血液系统疾病，如白血病、骨髓增生性疾病患者；严重肝、肾功能障碍，合并神经、精神系统疾病患者；依从性差、不能完成各种检查操作患者，如骨髓活检和基因检测；数据资料不完善等患者。所有患者完成血常规、骨髓活检和基因检测，本研究经本院伦理委员会审核通过，所有患者均知情同意。

根据2008年世界卫生组织关于PT的分类标准[5]：(1)外周循环静脉血中血小板计数持续升高≥450×109/L；(2)骨髓病理中以成熟体积增大的巨核细胞增多为主要表现，而无明显的中性粒细胞或红细胞增多；(3)可排除其他骨髓增殖性疾病，如真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、慢性粒细胞增多症等；(4)获得性JAK2V617F突变,或其他克隆标记,或在没有克隆标记情况下除外继发性血小板增多。最终确诊PT患者共154例(45.03%)，继发性血小板增多症188例。其中PT组男86例，女68例；年龄38～69岁，中位年龄53.4岁；血小板计数(463～3 547)×109/L，平均(865.3±65.4)×109/L。继发组男98例，女90例；年龄34～72岁，中位年龄56.3岁；血小板计数(357～2 451)×109/L，平均(732.8±82.3)×109/L。两组患者的性别、年龄和血小板计数差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 采用等位基因特异性-聚合酶链反应(AS-PCR)检测JAK2V617F和MPLW515L/K的点突变。主要步骤：(1)DNA合成。取外周静脉血500 μL加入2 mL EP管中，加入1 mL 4 ℃红细胞裂解液震荡30 s，10 000 r/min离心1 min；弃上清液，管底残留白色块状物加入125 μL蛋白酶震荡5 s；于65 ℃水浴器中孵育10 min，每2 min震荡1次,至沉淀完全溶解；加入275 μL蛋白清除液震荡5 s；-20 ℃放置10 min，12 000 r/min离心5 min；将上清液(含DNA)转移到另一个2 mL EP管中；加入500 μL 4 ℃冷藏乙醇，震荡使DNA沉淀,可看到半透明团块状的DNA；弃上清液，加入1 mL 70%乙醇震荡5 s，12 000 r/min离心1 min；倒去乙醇，使DNA风干；加入100 μL DNA溶解液，于65 ℃水浴器中孵育15 min充分溶解；测量其浓度和纯度。(2)引物设计。引物由上海生物工程有限公司设计合成，包括两条上游和一条公共下游引物，F-特异:5′-AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT ATT-3′；F-中间:5′-ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG-′；反向:5′-CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA-3′。MPLW515/K引物序列：F-M1：5′-AGT AGG GGC TGG CT GGA T-3′；R-M2：5′-CTA GTC GCC GAG GTG AGC-3′；特异-M3：5′-CTC CCT GTT GCT CTC CTT GT-3′；R-M2：5′-CAT CTC GTA ATG GTG TAG-3′。反应体系终体积25 μL，PCR扩增循环参数:95 ℃ 4 min,95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,共25个循环，72 ℃ 7 min结束。(3)基因测序。阳性标本用外侧引物重新PCR扩增后回收和纯化,上海生物工程有限公司进行测序。采用直接测序法检测CALR基因突变，DNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)9号外显子扩增引物(Invitrogen公司，5.0 pmol/μL)引物序列，F：5′-CTG GTC CTG GTC CTG ATG T-3′；R：5′-TCT CAC AGA GAC ATT ATT TGG C。反应体系终体积30 μL，反应条件：98 ℃ 3 min,98 ℃ 10 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共20个循环，72 ℃ 5 min结束。基因测序同上。

1.3观察指标 比较两组JAK2V617F、MPLW515L/K和CALR基因阳性突变率和相对表达水平。

2 结 果

2.13种基因突变测序结果 3种基因的突变型有两条电泳条带，野生型仅有1条；JAK2V617F位于第12号外显子，第一个碱基G被T取代，密码子由V变成F；点突变仅累及V617密码子，引起错义突变，未改变读码框。MPLW515L/K也未改变读码框。CALR基因突变有52 bp缺失和5 bp插入两种，所有突变位点均可引起读码框改变，CALR蛋白C端氨基酸序列改变。

PT组共检出89例(57.79%)JAK2V617F突变，7例(4.55%)MPLW515L/K突变，48例(31.17%)CALR突变；JAK2V617F和CALR同时突变阳性7例(4.55%)，同时阴性24例(15.58%)，JAK2V617F阳性且CALR阴性82例(53.25%)，JAK2V617F阴性且CALR阳性41例(26.62%)。继发组共检出6例(3.19%)JAK2V617F突变，0例MPLW515L/K突变，1例(0.53%)CALR突变。PT组的JAK2V617F和CALR突变率显著高于继发组，差异均有统计学意义(χ2=125.800、64.734，P<0.05)。

2.2ROC曲线分析 JAK2V617F和CALR同时突变阳性患者的JAK2V617F平均表达水平为0.34±0.06，CALR平均表达水平为0.15±0.04；同时阴性患者的平均表达水平为0.07±0.01和0.03±0.01；JAK2V617F阳性且CALR阴性患者的平均表达水平为0.58±0.04和0.04±0.01；JAK2V617F阴性且CALR阳性患者的平均表达水平为0.08±0.02和0.22±0.03。

以单独JAK2V617F突变诊断PT，曲线下面积(AUC)为0.721,95%CI为0.356～0.925，敏感度72.4%，特异度79.5%，cut off值为0.25；单独CALR突变的AUC为0.664,95%CI为0.291～0.848，敏感度为68.4%，特异度为82.4%，cut off值为0.09；JAK2V617F联合CALR突变的AUC为0.862,95%CI为0.467～0.963，敏感度为85.9%，特异度为87.8%，cut off值为0.21和0.07。见图1。

图1 ROC曲线分析

3 讨 论

JAK是一类非受体型酪氨酸蛋白激酶，编码JAK2的基因在9号染色体(9p24)上，JAK2几乎在所有组织中表达。JAK的典型结构为C端有两个催化区段,N端有3个保守结构区段,中部有两个区段。JAK的下游信号是信号转导子和转录激活子蛋白家族(STAT)，通过与细胞因子受体保守区BOX1和BOX2结合,识别受体近膜区域基因序列,进而发生一系列磷酸化,并选择性激活下游底物STAT,并转位到核内与特异性DNA调控元件结合而指导转录,即JAK-STAT途径[6]。JAK2V617F的发现为探索PT的发病机制提供了重要线索。

MPL为促血小板生成素受体,多肽序列全长有633个氨基酸。MPLW515L/K两种体细胞突变被证实存在于5%和1%的JAK2V617F阴性骨髓纤维化患者中[7]。MPLW515位于MPL内唯一的兼性区域,主要功能是抑制MPL基因的自发性激活。MPLW515L突变位于MPL基因细胞质与跨膜区接合处的抑制序列KWQFP内,突变可使序列抑制功能受损,从而组成性激活JAK-STAT信号传导通路[8]。CALR为Ca2+结合蛋白复合体，主要定位于内质网腔内，其介导的Ca2+稳态可调节巨核细胞分化成熟和血小板形成、整合素介导的信号转导、免疫应答、细胞凋亡、伤口愈合和纤维化等多种细胞功能[9]。KLAMPFL等[10]和NANGALIA等[11]采用外显子测序法在JAK2和MPL表达阴性的标本中检测到CALR第9个外显子突变，而在健康人群、淋巴系统肿瘤、急性白血病和实体肿瘤中均未发现CALR基因突变。

本研究发现，JAK2V617F和MPLW515/K突变不引起读码框改变，而CALR突变可导致读码框改变。PT组的JAK2V617F和CALR基因突变率显著高于继发组，而MPLW515/K突变率仅为4.55%。MPLW515/K较低的突变率可能与种族、样本量有关。本研究的创新点是在既往研究提示上述3种基因在MPN中有一定的突变率基础上，对门诊以单纯血小板持续升高就诊患者进行基因分析，提示JAK2V617F和CALR突变可作为筛选PT的特异性指标。本研究的不足是未涉及其他类型MPN，无法对JAK2V617F和CALR突变在不同类型MPN中进行比较。此外，本研究通过定量分析JAK2V617F和CALR相对表达水平，分别以单独JAK2V617F、CALR突变和联合两种指标突变诊断PT，发现联合两种指标诊断的敏感度、特异度和准确度明显提高，可为临床早期识别PT提供重要参考依据。

综上所述，PT中以JAK2V617F和CALR突变率较高，联合二者检测可明显提高诊断PT的敏感度、特异度和准确度。