原发性高血压患者血清miRNA-663水平与RAAS生化标志物的相关性分析

刘文果，陈石磊，万志佳，魏 星

(1.重庆市结核病防治所检验科 400050；2.陆军军医大学军事预防医学院防原医学教研室，重庆 400038；3.重庆市沙坪坝区妇幼保健计划生育服务中心检验科 400030；4.重庆市奉节县人民医院检验科 404600)

原发性高血压是以血压升高为主要临床表现的综合征，是多种心、脑血管疾病的重要病因和危险因素。原发性高血压会严重影响心、脑、肾等重要脏器的结构与功能，最终导致这些器官的功能衰竭，迄今其仍是心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。原发性高血压的发病机制十分复杂且不明确，目前研究表明原发性高血压是多因素、多层次共同作用的结果。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高血压病的发生、发展中发挥极其重要的作用[3-4]，肾素是RAAS调控血压的始动因子，是RAAS级联反应中的限速环节[5]。最近研究表明，miRNA在原发性高血压的发病机制中可能发挥了重要作用[6-7]。相关研究发现miRNA-663表达降低可引起肾素mRNA水平升高[8-10]，但原发性高血压患者miRNA-663的表达及其与RAAS生化标志物的相关性研究较少见报道。本研究观察了原发性高血压患者外周血血清miRNA-663表达水平及其与RAAS生化标志物的相关性，为原发性高血压的诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 原发性高血压组：2016年3月至2017年3月在奉节县人民医院门诊和住院的原发性高血压患者50例，均符合世界卫生组织及国际高血压协会对原发性高血压的诊断标准：Ⅰ级高血压为140～159/90～99 mm Hg，Ⅱ级高血压为160～179/100～109 mm Hg。其中男30例，女20例；年龄45～71岁，平均(58.4±6.8)岁；Ⅰ级高血压29例，Ⅱ级高血压21例。排除合并肾脏疾病、糖尿病和严重心脑血管疾病的患者。健康对照组：健康者50例，其中男30例，女20例；年龄45～70岁，平均(57.5±7.2)岁。两组的年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液标本处理 血液标本均在采集后立即处理：4 ℃ 2 000 r/min，离心10 min，收集血清，-80 ℃保存备用。

1.2.2血清miRNA-663测定

1.2.2.1miRNA的提取和纯化 采用mirVana PARIS Kit(Ambion公司，美国)试剂盒提取和纯化miRNA，取血清样品500 μL，室温下加入等体积变性液，立即充分混匀后加入等体积酸性酚氯仿，涡旋震荡30～60 s；室温下14 000 r/min离心5 min。取上清液于新管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，充分混匀后加入柱子中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；往柱子中加入700 μL洗液，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；往柱子中加入500 μL洗液，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；重复用500 μL洗液洗涤1次，弃滤液后12 000 r/min离心1 min；加入60 μL 95 ℃预热的缓冲液到柱子中，12 000 r/min离心1 min，收集miRNA立即进行反转录。

1.2.2.2反转录 采用TaqMan⑩MicroRNA 反转录试剂盒将提取的miRNA反转录成cDNA，按说明书操作。miRNA-663反转录的反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；miRNA-663反转录引物序列：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GCG GTC CC-3′；上游引物序列：5′-ACA CTC CAG CTG GGA GAT G-3′；下游引物序列：5′-ACT ATG GTG TCG TGG AGT CG-3′。U6反转录的反应条件：37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；U6反转录引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA ATA T-3′；上游引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游引物序列：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。

1.2.2.3实时荧光定量聚合酶链反应(PCR) 采用Maxima SYBR Green qPCR Kit(Thermo scientific，美国)试剂盒进行，按试剂盒说明书操作：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性20 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，重复40个循环，然后进行溶解曲线分析，结果采用比较阈值法计算，即目的基因的量=2-ΔΔct，ΔΔCT=(实验组目的基因Ct值-实验组管家基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组管家基因Ct值)。

1.2.3血清血管紧张素转换酶(ACE)活性测定 取适量血清，根据试剂盒操作说明书用化学比色法检测ACE活性，试剂盒购自Baomanbio公司(JK50235.2)。

1.2.4血清肾素(RA)、血管紧张素(Ang)Ⅱ、醛固酮(ALD)水平检测 取适量血清，根据试剂盒操作说明书采用放射免疫法检测血清RA、AngⅡ、ALD水平，试剂盒购自北京福瑞生物工程公司。

2 结 果

2.1两组受试者外周血miRNA-663表达 本研究通过提取两组受试者外周血miRNA，反转录后采用荧光实时定量PCR法检测了外周血miRNA-663表达，发现原发性高血压患者外周血miRNA-663表达相对于健康对照组显著下调(P<0.01)，相对于健康对照组，原发性高血压患者外周血miRNA-663表达下调了39.10%。见图1。

图1 两组受试者血清miR-663表达水平比较

2.2两组受试者外周血血清ACE活性及RA、Ang Ⅱ、ALD水平测定 分离两组受试者外周血血清，分别采用化学比色法和放射免疫法检测了外周血ACE活性及RA、Ang Ⅱ、ALD水平，发现原发性高血压患者外周血血清ACE活性及RA、Ang Ⅱ、ALD水平相对于健康对照组均显著上调(P<0.01)，原发性高血压患者外周血血清ACE活性升高了53.29%，外周血血清RA、Ang Ⅱ、ALD水平分别升高了38.61%、72.39%、54.23%。见表1。

2.3原发性高血压患者外周血血清miRNA-663水平与RAAS生化标志物的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，原发性高血压患者外周血血清miRNA-663水平与外周血血清ACE活性及RA、AngⅡ、ALD均呈显著负相关关系。见表2。

表1 两组受试者外周血血清ACE活性及RA、AngⅡ、ALD水平比较

注：与健康对照组比较，*P<0.01

表2 原发性高血压患者外周血血清miRNA-663水平与RAAS生化标志物的相关性分析

3 讨 论

原发性高血压是一种遗传因素和环境因素相互作用所致的心血管疾病，其发病机制复杂。研究结果显示，RAAS过度激活、交感神经活动亢进、血管内皮功能受损、自身免疫、炎性反应、氧化应激等均被证实参与了原发性高血压的发生，其相应的血液循环生化标志物在原发性高血压的发生、发展中发挥了重要作用[11-12]，在原发性高血压的诊疗、预防等方面也发挥了重要的提示作用。RAAS与血管舒张、收缩及水盐代谢关系密切，在高血压形成、发展中起着关键作用；在RAAS各个环节中，肾素、ACE、AngⅡ、ALD等起到了重要作用[13-14]。肾素主要由肾小球旁器的球旁细胞所合成，催化血管紧张素原产生AngⅠ，AngⅠ在ACE催化下形成AngⅡ，AngⅡ能够高效地收缩血管，增加ALD分泌，最终导致血压升高。

miRNA是一类长约22个碱基的非编码单链小分子RNA，其可作用于相应靶基因mRNA，在细胞增殖与分化、细胞凋亡、神经发育等多种生命活动中发挥调控作用。现在研究发现多种miRNA表达异常可能参与了原发性高血压的发生、发展[15-18]。在高血压性肾病患者肾脏髓质miRNA-181a表达降低可以引起肾素mRNA水平升高。GOYAL等[19]发现小鼠胎儿大脑中miRNA-27a、miRNA-27L的升高可以降低ACE-1蛋白水平。ESKILDSEN等[20]发现miRNA-132在AngⅡ介导的高血压大鼠心脏、大动脉及肾脏中高表达。

本研究通过对比研究发现，原发性高血压患者血清miRNA-663表达显著降低，同时发现原发性高血压患者的RAAS系统生化标志物ACE活性及RA、AngⅡ、ALD表达升高；通过相关性研究发现，原发性高血压患者血清miRNA-663水平与ACE活性及RA、AngⅡ、ALD水平呈显著负相关关系，提示miRNA-663可能有抑制原发性高血压患者RAAS系统活性升高的效应，miRNA-663可能在原发性高血压发生、发展过程中发挥重要效应，其有望成为原发性高血压诊断及区分严重程度的分子标志物，值得进一步研究探讨。