miR-107与非小细胞肺癌的临床病理特征及预后的关联

赵轲，张永建，刘奇，徐迪，陈宝钧

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院胸外科，武汉 430014）

肺癌是全球恶性肿瘤导致死亡的首要原因，每年超过100万患者死于肺癌［1-2］。肺癌分为小细胞肺癌 （small cell lung cancer，SCLC） 与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC） ，其中NSCLC占85%左右［3］。 虽然近年来多种治疗方法已经运用于NSCLC患者，但其5年的总生存率仍然较低 （仅为15%）［4］。因此，急待研究出更多新颖可靠的用来预测NSCLC患者预后的生物标记物。

miRNAs 作为一种长度约为19～24个核苷酸的小分子非编码单链RNA，主要通过转录后水平调控靶基因表达，从而参与多种生理病理活动，包括细胞的增殖、分化与凋亡等［5］。miR-107属于miR-103/107家族，在多种癌症中可被视为促癌因子［6］。研究［7-9］显示，miR-107可通过调控相关靶点，如高迁徙率族蛋白A2 （high mobility group A2，HMGA2） 或原肌球蛋白1 （targeting tropomyosin 1，TPM1） ，促进细胞增殖、分化及迁徙，从而刺激骨肉瘤、肝细胞瘤等癌症的发生、侵袭及转移。然而，miR-107的表达水平在NSCLC患者中的作用尚未完全明确，本研究旨在评估血浆miR-107的表达水平与NSCLC 患者临床病理特征及预后的联系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2010年4月1日至2012年3月31日在华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院胸外科入院确诊为原发性NSCLC并接受手术治疗的患者196例。所有NSCLC患者根据其临床特征、影像学检查和病理证实确诊。有肿瘤及恶性血液疾病史或并发其他复杂肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 、肺部感染等的患者均被排除在外。本研究已获得了华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院伦理委员会批准，所有涉及的被测试者都已告知研究方案，并签署知情同意书。

1.2 标本来源

在术后且未开始其他辅助治疗前 （包括化疗、放疗、免疫治疗等） 采集NSCLC患者静脉血，取血浆备用。此外，在术中肿瘤区域采集肿瘤组织样本。

1.3 RNA提取方法与实时PCR检测

利用Trizol Reagent （日本TaKaRa公司） 抽提总RNA，并通过分光光度计来检测RNA的浓度及纯度。随后，采用PrimerScript Real-time reagent kit （日本TaKaRa公司） 进行RNA逆转录，运用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司） 定量分析miRNA。所有的操作均严格按照制造商的操作说明执行。PCR反应以U6作为内参因子，采用2-△△Ct的方法计算血浆中miR-107的相对表达量。

1.4 评估与随访

采集所有患者的人口统计学、病理特征及临床症状等相关信息。此外，所有患者的肿瘤分期根据第7版的美国癌症联合委员会发布的癌症分期手册（AJCC7.0） 进行评估。随访截止日期为2016年8月31日，中位随访时间为 56个月。总生存期 （overall survival，OS） 和无病生存期 （disease free survival，DFS）的时间分别是从手术日期至由任何原因引起的死亡之间的时间，以及手术时间开始到出现肿瘤复发或由任何原因引起死亡之间的时间。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用Spearman检验分析miRNAs 表达与临床病理特征的相关性以及miR-107 分别在血浆和肿瘤组织样本中的相关性。采用Kaplan-Meier （K-M） 曲线和log-rank检验分析miR-107 与 DFS 和OS 的关系。并进一步采用单元、多元Cox风险回归模型进行评估miR-107与DFS及OS的关系。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基线信息

196例确诊为NSCLC的患者中，男118例，女78例；平均年龄 （59.43±9.73） 岁；根据NSCLC的组织病理学分型标准，腺癌87例 （44.4%） 、鳞癌 96例（49.0%） 、其他13 例 （6.6 %） ；肿瘤大小＞5 cm 80例（40.8%） 、≤5 cm 116例 （59.2%） ；血浆miR-107表达水平为0.675 （0.445～0.918） ；肿瘤组织miR-107 表达水平为2.216 （1.387～2.816） 。见表1。

2.2 血浆miR-107与肿瘤组织miR-107表达水平的关联分析

Spearman检验分析表明，miR-107在血浆和肿瘤组织中的表达水平均呈正相关 （r = 0.465，P ＜ 0.001） ，见图1。

2.3 血浆/肿瘤组织miR-107表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关联

在NSCLC患者中，血浆miR-107 与淋巴结转移呈正相关 （r = 0.168，P = 0.018） ；肿瘤组织miR-107与病理分化 （r = 0.304，P ＜ 0.001） 、肿瘤大小 （r =0.230，P = 0.001） 、淋巴转移 （r = 0.446，P ＜ 0.001） 以及 TNM分期 （r = 0.294，P ＜ 0.001） 正相关。见表2。

表1 基线信息Tab.1 Baseline characteristics

2.4 血浆和肿瘤组织miR-107表达水平与NSCLC患者DFS与OS的关联

图1 血浆和肿瘤组织miR-107表达水平关联分析Fig.1 Correlation of miR-107 expression in plasma and tumor tissue

本研究中，196例NSCLC患者术后5年的DFS为13.6%，OS则为32.8%。根据血浆和组织miR-107的表达水平的中位值，将患者分为高表达组与低表达组。采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验，发现血浆miR-107 高表达患者的DFS （P = 0.002） 和OS （P ＜0.001） 与低表达组相比较差；在肿瘤组织样本中，miR-107 高表达患者的DFS （P ＜ 0.001） 与OS （P ＜0.001） 与低表达组相比亦较差，见图2。

表2 miR-107与NSCLC患者特征的关联分析Tab.2 Correlation of miR-107 expression and clinicopathological features in patients with NSCLC

2.5 DFS与OS的预后因素分析

采用单元Cox风险回归模型分析NSCLC患者血浆和肿瘤组织中miRNA-107高表达量以及临床病理特征分别对于患者DFS和OS的影响，发现血浆miR-107 （P = 0.003） 和肿瘤组织中miR-107 （P＜0.001） 高表达与患者差的DFS显著相关，此外，低分化 （P = 0.003） 、肿瘤大小 （P = 0.024） 、淋巴结转移 （P ＜0.001） 及TNM分期 （P = 0.002） 也与患者短的DFS显著相关。进一步采用多元Cox回归模型分析NSCLC患者DFS的预测因素，结果显示，肿瘤组织中miR-107高表达 （P ＜ 0.004） 和淋巴结转移 （P = 0.010） 是NSCLC患者较短的DFS的独立预测因素。见表3。

此外，单元Cox分析显示，血浆miR-107高表达（P ＜ 0.001） 、 肿瘤组织miR-107高表达 （P ＜ 0.001） 、低分化 （P = 0.008） 、肿瘤大小 （P = 0.001） 、淋巴结转移 （P ＜ 0.001） 、高的TNM分期 （P ＜ 0.001） 均能预测患者较差的OS。多元Cox分析结果表明，血浆miR-107高表达 （P = 0.005） 、肿瘤组织miR-107高表达 （P ＜0.001） 与淋巴结转移 （P = 0.009） 是患者较差OS 的独立危险因素。见表4。

图2 miR-107表达水平与NSCLC患者DFS与OS的关联Fig.2 Correlation of miR-107 expression with DFS and OS in patients with NSCLC

表3 DFS的预后因素分析Tab.3 Analysis of prognostic factors for DFS

表4 OS的预后因素分析Tab.4 Analysis of prognostic factors for OS

3 讨论

虽然组织活检被视为目前评估肿瘤分期分型的首选方法，但其伴随的感染或出血等并发症仍让一些患者难以承受。相对而言，血液样本则容易获得且更让患者所接受［10］。因此，本研究采集了患者的血浆和组织样本，评估了miR-107在血浆和肿瘤组织中表达量的相关性，结果显示，NSCLC患者中miR-107在血浆和肿瘤组织中的表达水平呈正相关。

miR-107位于第10号染色体，在多种代谢活动中具有差异性表达，包括脂肪生成、细胞周期阻滞以及神经退行性疾病等［11］。miR-107的促癌作用在胃癌、乳腺癌及骨肉瘤等均得到了证实［7-8，12-13］。研究［9］表明，在肝癌组织中，有明显上调的miR-107，其可通过靶向调控轴抑制蛋白2 （axis inhibition protein2，Axin2） 的表达水平，从而促进了癌细胞的增殖；在胃癌组织中，过度表达的miR-107通过靶向调控大型肿瘤抑制因子2 （lager tumor suppressor，Lats2）的表达，从而促进癌细胞的增殖和迁徙［14］；在乳腺癌组织中，上调的miR-107可通过靶向调节Dicer1基因，从而促进上皮细胞到间质细胞的转化，导致肿瘤转移［12，15］。此外，有研究［16］评估了miR-107与恶性肿瘤临床病理特征及预后的关系，其中胃癌患者的miR-107不仅与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和肿瘤的阶段相关，而且高表达miR-107患者的DFS和OS比低表达患者差。同时NSCLC中上调的miR-107通过靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶8，增强了患者对顺铂的耐药性，因此，miR-107可用来预测NSCLC患者对于化疗的反应［11］。

与上述研究结果趋势相似，本研究发现，血浆miR-107 与淋巴结转移呈正相关，肿瘤组织miR-107与病理分化、肿瘤大小、淋巴转移以及 TNM分期正相关，可能与miR-107靶向调控Axin2或Dicer1等基因的表达水平，从而促进肿瘤细胞的增殖和迁徙作用有关［9，12］。此外，本研究还发现，血浆和肿瘤组织中miR-107高表达可预测患者较短的DFS和OS，多元Cox风险回归模型表明，血浆miR-107高表达可独立预测患者较差的OS，肿瘤组织中miR-107高表达可独立预测患者较短的DFS及OS，提示miR-107在NSCLC患者DFS和OS有潜在预测作用。这可能是由于miR-107通过刺激肿瘤细胞的增殖与迁徙，促进恶性肿瘤的浸润和淋巴结转移，继而影响患者的预后情况。此外，miR-107可提高患者对顺铂等化疗药物的耐药性，从而导致患者的不良预后［11，16］。

本研究仍有一些不足： （1） 本研究未纳入TNM分期为Ⅳ期NSCLC患者，因此未能评估miR-107对于Ⅳ期患者的预后作用； （2） 本研究的样本量相对较小，可能导致统计学效能相对大样本量较小； （3）本研究未涉及miR-107在NSCLC中的具体机制。因此，今后进一步的研究应扩大样本容量并纳入Ⅳ期NSCLC患者。

综上所述，本研究表明循环miR-107可作为一种新颖可靠的生物标记物，用于评估NSCLC患者的临床病理特征和预后情况。