糖胃安煎剂改善糖尿病大鼠空肠生物力学重构的机制研究

沙 洪 ，赵 东 ，廖东华 ，仝小林 ，Hans Gregersen，赵静波

（1.中日友好临床医学研究所 临床医学数据与项目管理平台，北京100029；2.Department of Clinical Medicine，Aarhus University， 8200 Aarhus N，Denmark；3.重庆大学生物工程学院，重庆 400044；4.中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

国际糖尿病联盟（IDF）2015年发布，全世界范围有4.15亿人患有糖尿病，中国占1.1亿人，糖尿病已成为影响国民健康重大公共卫生问题[1]。糖尿病并发胃肠道功能紊乱（DGID）发病率高达75%，与非糖尿病状态下单纯的胃肠道节律失常完全不一样，疗效不佳[2]。现代医学研究尚不能完全阐明DGID的发病机制。本研究通过检测链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠空肠肠壁脑源性神经营养因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其受体TrkA和TrkB表达变化，分析肠壁形态学和生物力学重构的相关性，探讨DGID发病可能机制及糖胃安作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：链脲佐菌素（美国Sigma公司），一抗和二抗（美国Abcam公司），血糖试纸（美国强生公司），10%水合氯醛。实验动物：采用清洁级雄性SD大鼠 （动物生产许可证号SCXK （京）2009-0007）30 只，体重 220～250g，清洁级饲料。 中国药品生物检定所实验动物中心提供。糖胃安煎剂：中国中医科学院广安门医院提供 （符合 《中国药典》质量标准），制备成浸膏，4℃保存，临用前稀释。采用超高效液相色谱质谱法测定化学组成，其主要成分柚皮甙、新橙皮甙、党参炔苷、白术内酯和大黄素。

1.2 方法

1.2.1 建立糖尿病模型实验

30只SD大鼠，10只设为对照组，20只注射链脲佐菌素（STZ）40mg/kg，造模成功后随机分为糖尿病组和糖胃安治疗组。

糖胃安组灌胃给药，10g/kg/d，周期60d。24h大鼠禁食，4%水合氯醛麻醉。取空肠上段，测量长度和湿重。从近端切取肠壁组织环，用于无载荷和零应力状态的研究；剩余肠段用于冲压实验。有关零应力状态研究，冲压实验和普通组织学的研究方法和结果我们已发表[3]。

1.2.2 免疫组化染色

取10%福尔马林固定小肠。酒精脱水，石蜡包埋，切片；60°C，60min；常规脱蜡；3%过氧化氢育10min，PBS冲洗抗原修复，滴加一抗，放入4°C冰箱过夜；二抗温育40min；PBS冲洗，DAB液显色约5～15min，苏木素复染，脱水、透明、封片。

1.3 数据分析

BDNF、TrkA和TrkB阳性染色区域均为棕黄色。根据成色在组织中的分布，通过公式计算BDNF、TrkA和TrkB在黏膜、黏膜下层和肌层染色的面积百分比：染色面积百分比=免疫染色阳性面积/测量总面积采用Sigmascan Pro4.0（Jandel Scientific，德国）专业图形处理软件确定有效测定区域，根据染色强度阈值确定和区分免疫染色范围和强度。利用Matlab程序 （MATLAB 7.1，The MathWorks公司，美国）计算BDNF、TrkA和 TrkB阳性染色面积比。

1.4 统计学方法

采用SigmaPlot11.0软件进行统计学分析。多组资料间比较采用单因素方差分析，BDNF、TrkA和TrkB的表达与形态组织学和生物力学重构参数的关系采用线性回归分析。

2 结果

2.1 体重和形态学指标

表1示，糖尿病组的空肠肠段单位重量/体重，无载荷壁厚和横截面积均显着高于正常组（均P＜0.01）。糖胃安能显著降低这些形态学参数（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 组织学测量指标

表2示，糖尿病组与正常组比较，其空肠肠壁的各层厚度均显著高于正常组（P＜0.05，P＜0.01）。糖胃安能显著降低黏膜层和黏膜下层的厚度（P＜0.05，P＜0.01），但对肌层无显著作用（P＞0.05）。

2.3 生物力学指标

表3示，糖尿病组与正常组比较，其展开角、内残余应变的绝对值，肠壁周向和轴向的常数a均显著增高（均P＜0.05）。糖胃安处理能显著降低展开角、内残余应变的绝对值，周向和轴向硬度（均 P＜0.05）。

表1 空肠肠段形态学测量结果（±s）

表1 空肠肠段形态学测量结果（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与糖尿病组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

形态学测量指标 正常组 糖尿病组 糖胃安组单位重量（g/cm）与体重（g）比 0.000237 ± 0.0000123 0.000719±0.0000401** 0.000389±0.0000637*#肠壁厚度 （mm） 1.07±0.06 1.34±0.06** 1.13±0.08*#肠壁横截面积（mm2） 10.38±0.87 15.64±0.78** 11.42±.04*##

表2 实验结束时肠壁各层厚度组织学测量结果（±s）

表2 实验结束时肠壁各层厚度组织学测量结果（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与糖尿病组比较，#P<0.05。

肠壁厚度 正常组 糖尿病组 糖胃安组黏膜（μm） 518.92±64.69 852.76±69.21**697.64±64.73*#黏膜下层 （μm） 17.67±1.35 23.12±1.34* 16.92±1.64#肌层 （μm） 56.04±2.68 68.64±2.92* 68.47±2.37*

表3 实验结束时生物力学指标测量结果（±s）

表3 实验结束时生物力学指标测量结果（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，#P<0.05。

生物力学指标 正常组 糖尿病组 糖胃安组展开角 （度） 103.4±18.6 142.1± 22.6* 91.6±16.8#内壁残余应变 -0.23±0.04 -0.29± 0.02* -0.22±0.02#外壁残余应变 0.27±0.07 0.32± 0.11 0.29±0.06周向材料参数 a 1.07±0.06 1.34± 0.06* 1.13±0.08#轴向材料参数 a 10.38±0.87 15.64± 0.78* 11.42±1.04#

2.4 免疫组化分析结果

BDNF，TrkA和TrkB在空肠肠壁中的分布结果如图1（见封二）和表4所示，黏膜、黏膜下层和肌层均有着色。糖尿病组与正常组相比，空肠肠壁各层BDNF、TrkA和TrkB染色显著减弱。除黏膜层BDNF和TrkA外，其余差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。糖胃安组与糖尿病组相比，空肠肠壁各层BDNF、TrkA和TrkB表达上调。除黏膜层BDNF和TrkA外，其余差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。

图1 各组空肠肠壁BDNF、TrkA和TrkB免疫组织化学染色结果举例。糖尿病组与正常组相比，空肠肠壁各层BDNF、TrkA和TrkB染色显著减弱。糖胃安组与糖尿病组相比，空肠肠壁各层BDNF、TrkA和TrkB表达上调。（标尺=100微米）

肠壁的单位湿重、肠壁壁厚和壁面积、肠壁各层厚度以及周向和轴向材料参数肠壁的单位湿重，肠壁壁厚和壁面积，肠壁各层厚度以及周向和轴向材料参数与BDNF、TrkA和TrkB表达呈显著负相关（R=0.357～0.825，P＜0.01）。 图 2 示一些相关分析的结果。

表4 BDNF、TrkA和TrkB各层染色面积百分比（%，±s）

表4 BDNF、TrkA和TrkB各层染色面积百分比（%，±s）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与糖尿病组比较，#P<0.05，##P<0.01。

检测蛋白 肠壁分层 正常组 糖尿病组 糖胃安组BDNF 黏膜层 0.197±0.026 0.185±0.041 0.207±0.021黏膜下层 0.576±0.029 0.432±0.024* 0.621±0.027#肌层 0.575±0.031 0.431±0.035* 0.691±0.027#TrkA 黏膜层 0.354±0.038 0.236±0.037* 0.257±0.032*黏膜下层 0.556±0.019 0.336±0.021** 0.526±0.017#肌层 0.525±0.045 0.288±0.036** 0.557±0.029##TrkB 黏膜层 0.332±0.029 0.173±0.015* 0.328±0.043#黏膜下层 0.479±0.048 0.309±0.022* 0.432±0.011#肌层 0.586±0.033 0.383±0.022* 0.496±0.015#

图2 相关分析结果举例

3 讨论

糖胃安煎剂是多年临床实践经验及研究形成的治疗DM胃肠病变的复方制剂，由白术、枳实、榔片、酒军、半夏、桃仁及小量人参组成。课题组以结构化信息采集数据为基础，归纳了门诊1331例（共计3030人次）病例数据，初步证明糖胃安方治疗糖尿病胃肠道功能紊乱具有健脾行气活血之功效，且副作用少，复发率低[4～6]。

神经营养因子（neurotrophic factors，NTFs）产生于胶质细胞和神经所支配的组织 （如平滑肌细胞）当中[7]。越来越多的研究证实：NTFs作为特殊的蛋白分子，可直接调控胃肠道功能[8，9]。小鼠动物实验中，BDNF可引起肠神经一平滑肌形态及功能重构，兴奋肠道平滑肌肌条的收缩活动，影响小鼠肠动力[10]。BDNF可增加小鼠回肠、近端结肠和远端结肠肌条的收缩幅度，表明BDNF可以兴奋回肠和结肠平滑肌肌条的收缩活性，发挥促进肠道动力作用[11]。在临床实验中，通过肌注给予BDNF等神经营养因子，逆转高血糖诱导的肠道病变，从而提高肠道动力[12，13]。

我们的前期基础试验证实：（1）糖尿病大鼠在高糖状态下，胃肠道平滑肌收缩的压力和应力的阈值发生了明显改变，其收缩张力对肌肉收缩刺激剂的反应也发生了明显变化，导致胃肠道平滑肌组织结构、构型异常，引起胃肠道形态学和被动生物力学发生了重构[3]。（2）1型和2型糖尿病大鼠的小肠平滑肌对充压刺激所引起应力-应变收缩的敏感性增加，单位平滑肌纤维的应力-应变的收缩力减弱[14，15]。即在糖尿病状态下，肠壁平滑肌收缩张力改变，胃肠道管壁组织的主动生物力学特性发生了重构，导致肠道功能受损，影响胃肠动力，最终发生 DGID[14,16～18]。 （3）我们研究还发现：糖胃安在一定程度上可以改善肠道组织结构和构型，恢复其生物力学特性异常，改善肠道组织的病理损害[3，19]。

本实验研究发现：发生生物力学重构的糖尿病大鼠肠壁组织中，BDNF及其受体TrkA、TrkB的表达水平下降，并且这些蛋白分子与生物力学重构具有一定相关性。糖胃安减轻胃肠道生物力学重构改善胃肠动力的同时，明显增加肠壁BDNF的表达水平。由于肠道平滑肌是肠道收缩的直接效应器，平滑肌细胞是生物力学主要的功能细胞，我们提出推测：在DGID的发生发展进程中，糖尿病状态导致胃肠道BDNF表达下降，直接影响平滑肌结构和功能，造成平滑肌收缩和张力异常，导致胃肠道生物力学重构，是最终导致糖尿病胃肠功能紊乱的途径之一。糖胃安煎剂可能通过影响胃肠道神经营养因子及其受体水平进对生物力学重构的改善发挥了作用。

4 参考文献