姜黄素对缺氧下大鼠星型胶质细胞的影响及机制研究①

高 枫 沈 娟 杨彦玲

(延安大学医学院，延安716000)

星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多的细胞，对中枢神经系统免疫调节可发挥重要作用，且影响多种疾病发生的病理过程[1]。研究显示，在多种缺氧导致的脑损伤疾病中，星形胶质细胞的增殖和活化明显增强，这提示星形胶质细胞可影响缺氧诱导的脑损伤的发生发展[2]。姜黄素是一种从姜黄等植物根茎中提取出来的天然有效成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎等多种生物活性，对神经有良好的保护作用[3]。有研究显示，姜黄素能使海马神经元分化增强[4]；可降低颅脑损伤后神经元细胞凋亡及炎症反应，从而对神经起到保护作用[5]；可增加丙烯腈诱导的星形胶质细胞活力及降低LDH的释放而对细胞损伤起保护作用[6]。但姜黄素对缺氧诱导的星形胶质细胞活力及凋亡影响机制还未清楚。因此，本研究检测姜黄素对缺氧诱导的星形胶质细胞活力及凋亡的影响，并进一步研究可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 新生2 d的SPF级Wistar大鼠，雌雄不限，共24只，购自延安动物中心；MTT试剂购自美国Gibco；膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)细胞凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；多聚赖氨酸购自美国Sigma公司；AG490购自美国BioLegend公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(Phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2)及磷酸化的信号转导与转录因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗体购自美国Abcam公司；酶标仪和流式细胞仪均购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1星形胶质细胞培养及分组 分离出大鼠大脑皮层，剪碎消化后接种于培养瓶中，37℃，20%O2孵育箱中培养1 h，细胞悬液重新种植于已事先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，每两天细胞换液一次，待瓶底长满95%细胞进行传代，取第三代成熟纯化的星形胶质细胞用于实验研究。

1.2.2细胞分组及缺氧处理 星形胶质细胞分为对照组、缺氧组和缺氧+姜黄素组。对照组在37℃和5%体积分数的CO2及95%空气培养箱中培养，缺氧组进行一次换液后在4%体积分数的O2、5%体积分数的CO2及91%体积分数的N2混合气体中培养，缺氧+姜黄素组细胞换液后加入10 μmol/L姜黄素培养1 h后再在缺氧混合气体中培养。

1.2.3各组细胞活力检测 通过MTT法检测各组细胞活力。收集缺氧处理24 h的细胞，每孔细胞中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，培养箱中培养4 h，弃掉培养液，加入100 μl的DMSO，充分震荡混匀15 min，酶标仪于570 nm波长测定各组的吸光度值(OD值)，取均值。以OD值反映细胞活力，可间接反映出细胞的增殖能力。实验重复3次。

1.2.4各组细胞凋亡检测 细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染法，通过流式细胞仪检测。收集缺氧处理24 h的细胞，预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，胰酶消化细胞，制备成单细胞悬液。避光冰上加入Annexin V-FITC和PI的稀释液各5 μl，充分混匀，室温避光培养10 min，再加入400 μl冷却的结合缓冲液，1 h内上流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察各组细胞的凋亡百分比。实验重复3次。

1.2.5姜黄素对Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响 细胞中加入裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，每孔道加入40 μg蛋白，行SDS-PAGE电泳，电泳结束后电转移至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭后4℃孵育一抗过夜，一抗Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3均1∶500稀释，内参GAPDH按照1∶1 000稀释，洗膜。加入1∶10 000 稀释的二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)，洗膜，室温水平摇床摇动孵育1 h，洗膜，化学发光法在紫外凝胶成像仪上进行拍照分析。

1.2.6抑制JAK2/STAT3信号通路对细胞活力及凋亡的影响 星形胶质细胞分为缺氧+姜黄素组和缺氧+姜黄素组+AG490组(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)，其中AG490的剂量为10 mol/L，细胞培养24 h，通过CCK8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达。

2 结果

2.1姜黄素对大鼠星型胶质细胞活力的影响 MTT法检测姜黄素对缺氧诱导的大鼠星型胶质细胞活力的影响，结果如表1所示，缺氧组细胞活力显著高于对照组(t=8.593，P=0.000)，而缺氧+姜黄素组细胞活力显著低于缺氧组(t=4.930，P=0.003)。

2.2姜黄素对大鼠星型胶质细胞凋亡的影响 采用Annexin V-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测姜黄素对缺氧诱导的大鼠星型胶质细胞凋亡的影响，结果如图1和表2所示，缺氧组细胞凋亡率显著高于对照组(t=9.756，P=0.000)，而缺氧+姜黄素组细胞凋亡率显著低于缺氧组(t=4.429，P=0.004)。

表1姜黄素对大鼠星型胶质细胞的影响

Tab.1Effectofcurcuminonastrocytesinrats

GroupsODControl group0.326±0.042Hypoxia group0.692±0.0641)Hypoxia+curcumin group0.482±0.0482)F37.186P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the hypoxia group,2)P<0.05.

2.3姜黄素对大鼠星型胶质细胞凋亡蛋白及JAK2/STAT3信号通路的影响 通过Western blot检测Bcl-2家族抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和JAK2/STAT3信号通路p-JAK2及p-STAT3的蛋白表达，结果如图2和表3所示，与对照组比较，缺氧组Bcl-2蛋白表达显著降低(tBcl-2=11.764，PBcl-2=0.000)，Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达显著升高(tBax=10.396，PBax=0.000；tp-JAK2=15.409，Pp-JAK2=0.000；tp-STAT3=13.221，Pp-STAT3=0.000)；与缺氧组比较，缺氧+姜黄素组Bcl-2蛋白表达显著升高(tBcl-2=6.171，PBcl-2=0.001)，Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达显著降低(tBax=4.877，PBax=0.003；tp-JAK2=9.575，Pp-JAK2=0.000；tp-STAT3=6.611，Pp-STAT3=0.001)。

表2姜黄素对大鼠星型胶质细胞凋亡的影响

Tab.2Effectofcurcuminonapoptosisofratastrocytes

GroupsApoptosis rate(%)Control group1.47±0.23Hypoxia group6.47±0.871)Hypoxia+curcumin group4.20±0.612)F47.727P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the hypoxia group,2)P<0.05.

2.4抑制JAK2/STAT3信号通路对大鼠星型胶质细胞活力及凋亡的影响 MTT及流式细胞仪分别检测姜黄素及姜黄素和JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490联合对缺氧诱导的大鼠星型胶质细胞活力及凋亡的影响，结果如图3和表4所示，与缺氧+姜黄素组比较，缺氧+姜黄素+AG490组细胞活力显著降低(t=4.461，P=0.011)，细胞凋亡率显著降低(t=5.747，P=0.005)。

2.5抑制JAK2/STAT3信号通路对大鼠星型胶质细胞凋亡蛋白及JAK2/STAT3信号通路的影响 缺氧+姜黄素组和缺氧+姜黄素+AG490组Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达结果如图4和表5所示，缺氧+姜黄素+AG490组Bcl-2蛋白表达显著高于缺氧+姜黄素组(tBcl-2=9.420，PBcl-2=0.001)，Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达显著低于缺氧+姜黄素组(tBax=6.851，PBax=0.002；tp-JAK2=10.392，Pp-JAK2=0.001；tp-STAT3=8.441，Pp-STAT3=0.001)。

图2 姜黄素对大鼠星型胶质细胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响Fig.2 Effect of curcumin on expression of Bcl-2,Bax,p-JAK2 and p-STAT3 protein in rat astrocytesNote: 1.Control group;2.Hypoxia group;3.Hypoxia + curcumin group.

表3姜黄素对大鼠星型胶质细胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响

Tab.3EffectofcurcuminonexpressionofBcl-2,Bax,p-JAK2andp-STAT3proteininratastrocytes

GroupsProtein relative expressionBcl-2Baxp-JAK2p-STAT3Control group0.388±0.0450.114±0.0180.021±0.0080.039±0.007Hypoxia group0.083±0.0101)0.421±0.0481)0.367±0.0421)0.251±0.0281)Hypoxia+curcumin group0.243±0.0302)0.277±0.0362)0.152±0.0212)0.145±0.0182)F69.24854.112121.04687.402P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the hypoxia group,2)P<0.05.

图3 抑制JAK2/STAT3信号通路对大鼠星型胶质细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway on apoptosis of rat astrocytes

表4抑制JAK2/STAT3信号通路对大鼠星型胶质细胞活力及凋亡率的影响

Tab.4EffectofinhibitionofJAK2/STAT3signalingpathwayonviabilityandapoptosisrateofastrocytesinrats

GroupsODApoptosis rate(%)Hypoxia+curcumin group0.523±0.0514.15±0.57Hypoxia+curcumin+AG490 group0.302±0.0691)2.23±0.401)

Note：Compared with the hypoxia+ curcumin group,1)P<0.05.

表5抑制JAK2/STAT3信号通路对大鼠星型胶质细胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响

Tab.5EffectofinhibitionofJAK2/STAT3signalingpathwayonexpressionofBcl-2,Bax,p-JAK2andp-STAT3proteininratastrocytes

GroupsProtein relative expressionBcl-2Baxp-JAK2p-STAT3Hypoxia+curcumin group 0.178±0.0210.258±0.0290.121±0.0120.237±0.032Hypoxia+curcumin+AG490 group0.534±0.0621)0.127±0.0161)0.031±0.0091)0.075±0.0091)

Note：Compared with the hypoxia+ curcumin group,1)P<0.05.

图4 抑制JAK2/STAT3信号通路对大鼠星型胶质细胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达的影响Fig.4 Effect of inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway on expression of Bcl-2,Bax,p-JAK2 and p-STAT3 protein in rat astrocytesNote: 1.Hypoxia+ curcumin group;2.Hypoxia+ curcumin+AG490 group.

3 讨论

星形胶质细胞在大脑中有广泛分布，维持大脑的稳态，对大脑有保护作用，而在缺氧条件下星形胶质细胞活性升高，影响脑损伤的发生及发展[7]。姜黄素是常用的中药姜黄的有效成分，有多种药理作用，如抗凋亡、抗炎、抗氧化等，有很高的应用价值。研究显示，姜黄素可通过降低免疫因子TNF-α、IL-6释放而抑制LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应[8]；姜黄素可抑制TNF-α诱导后星形胶质细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达[10]；姜黄素可通过下调NF-κb信号降低星形胶质细胞的活化[9]。姜黄素对缺氧诱导的星形胶质细胞活力及凋亡影响还未明确。有研究显示，4、10、20、40、80 μmol/L的姜黄素均可降低正常培养的星形胶质细胞活力，40、80 μmol/L的姜黄素的抑制率分别为81.8%和40.6%，因此，本研究选择10 μmol/L的姜黄素作为实验浓度。

通过姜黄素处理缺氧诱导的星形胶质细胞，MTT及流式细胞仪分别检测细胞活力及凋亡率，结果显示，缺氧可提高细胞的活力及凋亡率，而姜黄素可缓解这一效应。细胞凋亡受到Bcl-2家族的调控，Bcl-2家族有促凋亡及抑凋亡蛋白，Bcl-2为抑凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，细胞凋亡由两者比例决定，Bcl-2表达降低，而Bax表达升高则促进细胞凋亡，反之则抑制细胞凋亡[11-14]。有研究显示，星形胶质细胞中可通过调节Bcl-2和Bax表达促进或抑制细胞的凋亡[13,14]。本研究结果显示，缺氧可下调Bcl-2表达，上调Bax表达，而姜黄素可缓解此效应。提示姜黄素可通过调节Bcl-2和Bax表达降低缺氧诱导的星形胶质细胞凋亡。

JAK2/STAT3信号通路是由多种细胞因子激活的一种信号转导通路，参与多种疾病的发生发展[15-17]。有研究显示，在难治性癫痫患者脑组织中神经胶质细胞JAK2/STAT3信号通路p-JAK2和p-STAT3表达明显高于对照组[18]。姜黄素可通过下调JAK2/STAT3信号通路降低小胶质细胞的活力[19]，姜黄素是否可通过调控JAK2/STAT3信号通路影响星型胶质细胞活力及凋亡还未可知，本研究检测到姜黄素可降低缺氧引起的星型胶质细胞中p-JAK2和p-STAT3表达的升高，通过加入JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490，将细胞分为缺氧+姜黄素组和缺氧+姜黄素+AG490组，检测姜黄素是否通过调控JAK2/STAT3信号通路而对细胞产生影响，结果发现缺氧+姜黄素+AG490组细胞活力和凋亡率均明显低于缺氧+姜黄素组。这提示姜黄素还可以通过JAK2/STAT3信号通路调节细胞活力。

综上所述，姜黄素可降低缺氧下大鼠星型胶质细胞活力，降低细胞凋亡，其调节机制与JAK2/STAT3信号通路有关。本研究提示姜黄素可通过影响星型胶质细胞活力和细胞凋亡而对脑损伤起保护作用，可能成为脑损伤治疗的有效药物。