五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠存活和VEGF表达的影响①

乔利峰 董文韬 李 杰 雷春涛 曲 超 林 伟

(四川省医学科学院、四川省人民医院眼科,成都610072)

视网膜母细胞瘤是视网膜发育过程中出现的恶性肿瘤，是儿童期常见的肿瘤[1]。约三分之二的患者在2岁之前被确诊，在5岁之前被诊断约为95%[2]。视网膜母细胞瘤会给患者及其家庭成员带来心理影响，造成严重的社会经济负担[3,4]。因此，加强对视网膜母细胞瘤的研究对人类医疗健康系统及社会发展具有重要意义。据报道苦参碱、诃黎勒鞣花酸及川芎嗪等一些植物提取物有利于视网膜母细胞瘤的治疗[5-7]。五味子作为一种传统中药，在神经保护、抗炎、抗氧化和解毒等方面发挥着积极作用[8,9]。五味子乙素(Schisandrin B,SchB)是五味子果实的主要活性成分之一，属于联苯环辛烯类木脂素，常被用于炎症相关疾病的治疗，如肝炎、骨髓炎、妇科疾病及心肌疾病等[10]。另外五味子乙素还具有多种抗癌功能，有利于神经胶质瘤、肺癌及胆管癌等癌症的治疗[11-13]。但关于五味子乙素在视网膜母细胞瘤中作用的报道还十分罕见，有待进一步研究。本研究的主要目的是探索五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠存活和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 视网膜母细胞瘤细胞系Y79购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)；3周龄，体重20 ～ 24 g的裸鼠来源于中国科学院实验动物中心；五味子乙素(HPLC≥98%)购自Solarbio；RPMI1640培养基及胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxynucleo-tidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色试剂盒购自美国罗氏公司；抗血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体、抗血管内皮细胞生长因子受体2 (Vascular endothelial growth factor Receptor 2,VEGFR2)抗体、抗P38抗体、抗磷酸化p38 (Thr180/Tyr182) (P-P38)抗体、抗Hsp27抗体和抗磷酸化-HsP27 (Ser82)(P-Hsp27)抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 Y79细胞放置于添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养液中,并置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。当细胞增殖到约80%时进行传代。取对数生长期细胞进行移植。

1.2.2视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠模型的建立 将0.1 ml的Y79细胞(5×107个/ml) 注射于裸鼠皮下，接种后继续在无菌条件下常规饲养，观察成瘤情况。当肿瘤体积大于50 mm3时达到成瘤标准，将40只成瘤裸鼠随机分为4组：移植瘤模型 (Y79) 组、五味子乙素低中高剂量(10、20、50 mg/kg BW)组，每组10只。五味子乙素处理组于成瘤裸鼠肿瘤内注射五味子乙素(10、20、50 mg/kg BW)，连续7 d。移植瘤模型 (Y79) 组用生理盐水替代五味子乙素。每5 d测量肿瘤体积大小，肿瘤体积=1/2×长径×短径2。绘制肿瘤生长曲线及存活曲线。

1.2.3TUNEL染色 五味子乙素处理成瘤裸鼠30 d后，取出肿瘤组织。PBS清洗8次，去掉坏死组织及血凝块。再用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脱水10 min。脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋及切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20℃～37℃处理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室温孵育20 min，随后PBS清洗3次。然后按照试剂盒说明书进行生物素标记，显色，苏木素复染，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。最后显微镜下观察拍照，细胞核呈棕色颗粒的为凋亡细胞。

1.2.4免疫组化染色 石蜡切片经常规脱蜡及水化后用1% 的Triton X-100处理15 min，再用3% 的H2O2处理15 min。5% 的羊血清封闭30 min后依次孵育抗VEGF抗体，4℃,过夜。第2天孵育对应的二抗，37℃、30 min。最后进行染色封片。

1.2.5蛋白印迹 首先肿瘤组织于含蛋白酶抑制剂的裂解液中冰上匀浆，提取总蛋白，100℃变性5 min。等量的蛋白再进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。5%的BSA封闭1 h，加入相应的一抗，4℃过夜孵育。第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液，于凝胶成像仪进行曝光拍照，统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.01认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤生长的影响 为分析五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤生长的影响，每5 d测量肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。图1显示，五味子乙素处理视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠30 d后，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)组肿瘤体积小于移植瘤模型组(P<0.01)。上述结果表明，五味子乙素可抑制视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤的生长。

2.2五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠存活率的影响 统计各组裸鼠的存活率分析五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠存活的影响。由图2可知，50 mg/kg的五味子乙素处理健康裸鼠未出现死亡。五味子乙素(10、20、50 mg/kg)组裸鼠存活率高于移植瘤模型组(P<0.01)。以上结果说明，五味子乙素可提高视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠存活率。

2.3五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠细胞凋亡的影响 通过TUNEL染色分析五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响。如图3所示，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡高于移植瘤模型组(P<0.01)。由此可见，五味子乙素可促进视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织细胞凋亡。

2.4五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠VEGF表达的影响 利用免疫组化染色检测VEGF表达，分析五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织中VEGF表达的影响。图4显示，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)组裸鼠肿瘤组织中VEGF表达低于移植瘤模型组(P<0.01)。上述结果表明，五味子乙素可减弱视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织中VEGF表达。

图1 五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤生长的影响Fig.1 Effect of schisandra B on growth of tumor in retinoblastoma implantation nude miceNote:SchB.Schisandra B;**.P<0.01，vs Y79.

图2 五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠存活率的影响Fig.2 Effect of schisandra B on survival rate of retinoblastoma implantation nude miceNote:SchB.Schisandra B;**.P<0.01，vs Y79.

2.5五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠VEGF下游通路活性的影响 为分析五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠VEGF介导的信号通路的影响，蛋白印迹检测肿瘤组织中VEGFR2、P38、P-P38、Hsp27和P-Hsp27蛋白水平。由图5可知，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)组裸鼠肿瘤组织中VEGFR2蛋白水平及P-P38/P38和P-Hsp27/Hsp27比值低于移植瘤模型组(P<0.01)。以上结果说明，五味子乙素可降低视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织中VEGFR2表达及P38和Hsp27磷酸化水平，抑制VEGF信号通路的活化。

图3 五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠细胞凋亡的影响(×200)Fig.3 Effect of schisandra B on apoptosis in retinobla-stoma implantation nude mice(×200)Note:The apoptotic cells was stained brown.SchB.Schisandra B;**.P<0.01,vs Y79.

图4 五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠VEGF表达的影响(×200)Fig.4 Effect of schisandra B on expression of VEGF in retinoblastoma implantation nude mice(×200)Note:The VEGF positive cells was stained brown.SchB.Schisandra B;**.P<0.01,vs Y79.

图5 五味子乙素对视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠VEGF下游通路蛋白表达的影响Fig.5 Effect of schisandra B on expression of downstream of VEGF pathway related proteins in retinoblastoma implantation nude miceNote:SchB.Schisandra B;**.P<0.01 vs Y79.

3 讨论

据统计全球每年约有8 000例新增视网膜母细胞瘤病例，患者的存活率小于30%[14]。视网膜母细胞瘤的治疗是相当复杂的，涉及治疗策略的选择，包括摘除术、放疗、化疗、激光光凝、热疗和冷冻治疗等。目前化学疗法已成为最常见的眼科治疗方式。视网膜母细胞瘤的化疗有四种途径，包括静脉内、动脉内、眼周内和血管内的化疗，但这些方法存在毒副作用大及院内传播等缺点[15-17]。越来越多的研究表明植物提取物在各类疾病的治疗方面发挥着积极作用[18-20]。

细胞增殖及凋亡对肿瘤的发生发展十分重要，大量文献报道五味子乙素具有调控肿瘤生长及细胞凋亡的功效。Xiang等[10]发现五味子乙素可抑制胆囊癌肿瘤的生长。有研究发现五味子乙素还可抑制胆管癌移植癌裸鼠肿瘤的生长，促进细胞凋亡[13]。据报道五味子乙素处理神经胶质瘤异种移植癌裸鼠后，肿瘤生长明显变慢，细胞凋亡增加[21]。有数据显示五味子乙素可通过mTOR通路抑制神经胶质瘤增殖及转移[22,23]。本文结果显示，五味子乙素可抑制视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤的生长，提高存活率，促进肿瘤组织细胞凋亡。

VEGF在癌症中起着重要的调控作用，越来越多的研究表明植物提取物具有调节VEGF表达的作用。Zhang等[24]发现肉桂提取物可降低卵巢癌肿瘤组织中VEGF表达。有数据显示五味子多糖提取物可降低肾细胞癌肿瘤组织VEGF表达[25]。本文结果显示，五味子乙素可减弱视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织中VEGF表达。

VEGFR2介导的P38-Hsp27信号通路在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用,VEGFR2可促进P38和Hsp27磷酸化,激活P38和Hsp27[26,27]。许多植物提取物都可影响VEGFR2信号通路。Han等[28]发现银杏外种皮提取物可降低肺癌小鼠VEGF及VEGFR2表达。有研究表明一种奎尼酸衍生物可降低视网膜内皮细胞P38的磷酸化水平[29]。有数据显示五味子提取物可降低IL-1β诱导人关节软骨细胞P38的磷酸化水平[30]。本研究结果显示，五味子乙素可降低视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠肿瘤组织中VEGFR2表达及P38和Hsp27磷酸化水平，抑制VEGF信号通路的活化。

本研究表明，在视网膜母细胞瘤移植癌裸鼠中，五味子乙素可抑制肿瘤生长、提高存活率、促进细胞凋亡、减弱VEGF及VEGFR2表达，降低P38和Hsp27磷酸化水平。后续研究将从肿瘤细胞转移及血管新生方面探讨五味子乙素对视网膜母细胞瘤的影响，为视网膜母细胞瘤的治疗提供参考。