Kindlin-2介导足细胞损伤在局灶节段肾小球硬化症模型小鼠发病中的作用研究

任凌燕 朱 鸣 霍丽霞 王霄一

局灶节段肾小球硬化症（FSGS）发病机制尚不明确，现有研究主要聚焦在遗传突变[1]、循环渗透因子[2]、机械应力[3]等非免疫因素导致的足细胞损伤与丢失。Zhang等[4]研究表明，FSGS伴随着足细胞损伤及某些细胞因子的激活，但具体发病机制不清楚。Qu等[5]发现Kindlin-2通过与磷肌醇类、整合素的相互作用进一步调节足细胞黏附与纤维连接蛋白的沉积，提示Kindlin-2参与了肾小球疾病。Wei等[6]研究表明，敲低Kindlin-2可以有效减轻UUO小鼠的肾脏纤维化。本实验通过建立小鼠局灶节段肾小球硬化症-阿霉素肾病模型，探讨Kindlin-2在局灶节段肾小球硬化症模型小鼠足细胞损伤发病中的作用。

1 实验材料

1.1 动 物 8周龄健康雄性SPF级BALB/C小鼠36 只，体质量（27.5±2.5）g，所有动物均采购自南京大学模式动物研究所，动物许可证号：SYXK（苏）2015-0001，饲养于浙江中医药大学实验动物中心SPF级动物房，温度24～28℃，湿度75%左右，以标准饲料饲养，自由饮水及摄食，适应性喂养1周。

1.2 药物与试剂 阿霉素（adriamycin，ADR，北京索莱宝科技有限公司，批号H44024359，用生理盐水配制成浓度2mg/mL）；兔抗鼠肾母细胞瘤（WT-1）多克隆抗体（abcam，批号 ab89901）；FITC标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物科技有限公司，批号ZF-0311）；小鼠尿微量白蛋白ELISA检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号E038）；小鼠血清白蛋白（ALB，南京建成生物科技有限公司，批号A028-1）；小鼠血清总胆固醇ELISA检测试剂盒（TC，南京建成生物科技有限公司，批号C011-2）；总RNA提取试剂盒（TaKaRa公司，批号9108Q）；逆转录试剂盒（TaKaRa公司，批号RR047A）；PCR引物合成（上海生工生物合成有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 36只雄性BALB/C小鼠适应环境1周，采用抽签法随机分为正常对照组和模型组，各18只。参照文献[7]，模型组小鼠通过尾静脉单次注射阿霉素（ADR）10mg/kg鼠重，正常对照组注射等容积的生理盐水。

2.2 血液及尿液收集及测定 分别于给药后第4、8、12周，每组随机抽取6只，使用小鼠代谢笼收集24h尿液，采用小鼠心脏取血。按照ELISA试剂盒说明书步骤测定24h尿蛋白定量及血清白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）的水平。

2.3 肾脏组织取材及病理学改变 于造模结束后第4、8、12周每组随机各处死6只小鼠，取其中一个肾组织的1/4固定于体积分数10%的甲醛溶液，行PAS、MASSON染色，观察两组小鼠肾脏组织病理学变化情况。剩余3/4的肾脏组织用湿生理盐水纱布包裹，存于液氮中备用。

图3 两组小鼠肾小球WT1表达（IHC ×400）

图4 Kindlin-2mRNA水平与足细胞数量、Nephrin mRNA及Podocin mRNA水平相关性分析

2.4 WT1免疫组化计数足细胞数量 利用免疫组织化学技术检测WT1在两组小鼠肾小球内的表达，采用disector/fractionator方法计数两组小鼠的足细胞数量[8]。

2.5 RT-qPCR 按照TaKaRa RNAiso Plus说明书提取组织总RNA。将已提取的组织总RNA按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书进行反转录，将反转录得到的cDNA保存于4°C冰箱备用。引物序列由上海生工生物合成有限公司合成，β-actin上游引物：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'；Kindlin-2 上游引物：5'-TGGACGGGATAAGGATGCCA-3'，下游引 物 ：5'-TGACATCGAGTTTTTCCACCAAC-3'；Podocin上游引物：5'-GCATCAAGCCCTCTGGATTAG-3'，下游引物：5'-AGACGGAGATCAACCTTGTGATA-3'；Nephrin 上游引物：5'-ATGGGAGCTAAGGAAGC CACA-3'，下游引物：5'-CCACACCACAGCTTAACTGTC-3'。于实时定量PCR仪进行PCR反应，反应的条件：95℃预变性 3min，95℃变性 10s、60℃退火 30s、55℃延伸30s，共48个循环。以β-actin mRNA表达作为内参照，以2^-△△ct表示mRNA的相对表达水平。行Kindlin-2 mRNA水平分别与Nephrin mRNA水平、Podocin mRNA水平的相关性分析。

图1 两组小鼠肾脏组织病理（PAS×200）

图2 两组小鼠肾脏组织病理（MASSON ×200）

2.6 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示。组间差异比较采用重复测量方差分析。采用Spearman方法进行相关性分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 两组小鼠24h蛋白尿定量比较 模型组小鼠第4周24h尿蛋白定量显著增加，并达到高峰，且大量蛋白尿一直持续到实验结束，与对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表 1。

表1 两组小鼠24h尿蛋白定量比较（mg/24h，±s）

表1 两组小鼠24h尿蛋白定量比较（mg/24h，±s）

注：与对照组相同时间点比较，*P＜0.05

组别正常对照组模型组鼠数6 6 4W 1.72±0.62 5.66±1.06*8W 1.77±0.63 4.63±1.16*12W 1.69±0.49 4.78±0.87*

3.2 两组小鼠血清ALB、TG水平比较 模型组小鼠血清ALB水平明显降低，至第4周降至最低，8周后有所上升，且低蛋白血症一直持续到实验结束，与对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）。模型组小鼠血清TC水平显著增加，第4周达到高峰，8周后有所下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表 2-3。

表2 两组小鼠血清ALB水平比较（g/L，±s）

表2 两组小鼠血清ALB水平比较（g/L，±s）

注：与正常对照组相同时间点比较，*P＜0.05；ALB：血清白蛋白

组别正常对照组模型组鼠数6 6 4W 22.27±1.41 11.98±1.33*8W 22.65±1.49 12.78±1.47*12W 23.31±1.49 12.99±1.38*

表3 两组小鼠血清TC水平比较（mmol/L，±s）

表3 两组小鼠血清TC水平比较（mmol/L，±s）

注：与正常对照组相同时间点比较，*P＜0.05；TC：总胆固醇

组别正常对照组模型组鼠数6 6 4W 2.01±0.49 8.84±1.30*8W 2.06±0.49 7.45±1.27*12W 2.10±0.54 6.79±1.38*

3.3 肾脏病理改变 模型组小鼠肾脏组织第4周可见部分肾小球出现系膜基质和系膜细胞轻度增生，伴有足细胞轻度肿胀；第8周部分肾小球出现系膜基质和系膜细胞中度增生，伴有明显的足细胞肿胀增殖，血管袢和肾小球囊粘连，肾小管可见大量蛋白管型，肾间质有少许中性粒细胞及淋巴细胞浸润；第12周弥漫性肾小球出现系膜基质和系膜细胞重度增生，足细胞增生明显，肾小管内可见大量蛋白管型，部分肾小管萎缩，肾间质小动脉管壁增厚、管腔狭窄，间质少量纤维化。见插页图1-2。

3.4 两组足细胞数量差异 WT1是足细胞胞核的特异性标记，它通常用来计数足细胞的数量。随着时间的进展，模型组小鼠足细胞数量逐渐减少。4周末足细胞数量开始减少，12周末明显减少。见封三图3，见表 4。

表4 两组小鼠足细胞计数（个/肾小球，±s）

表4 两组小鼠足细胞计数（个/肾小球，±s）

注：与正常对照组相同时间点比较，*P＜0.05

组别正常对照组模型组鼠数6 6 4W 104.00±10.05 77.40±7.56*8W 103.80±12.23 63.27±8.51*12W 98.86±8.89 53.15±8.23*

3.5 实时荧光定 PCR检测 Kindlin-2、Nephrin、Podocin mRNA相对表达量 模型组小鼠第4、8、12周肾组织Kindlin-2 mRNA水平明显高于对照组（P＜0.05 或 P＜0.01）；模型组小鼠第 8、12 周肾组织Nephrin mRNA水平明显低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）；模型组小鼠第 4、8、12 周肾组织 Podocin mRNA水平明显低于对照组（P＜0.05或 P＜0.01）。见表5。

3.6 Kindlin-2 mRNA水平与足细胞数量、Nephrin mRNA及Podocin mRNA水平相关性分析 直线相关分析显示，Kindlin-2 mRNA水平与足细胞数量（r=-0.02，P＜0.01）、Nephrin mRNA 水平（r=-0.8，P＜0.01）、Podocin mRNA 水平（r=-0.9，P＜0.01）呈显著负相关。见封三图4。

表5 Kindlin-2、Nephrin及Podocin mRNA相对表达量比较（±s）

表5 Kindlin-2、Nephrin及Podocin mRNA相对表达量比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；ADR-4W：阿霉素诱导后第4周；ADR-8W：阿霉素诱导后第8周；ADR-12W：阿霉素诱导后第12周

组别正常对照组ADR-4W组ADR-8W组ADR-12W组鼠数6 6 6 6 kindlin-2 0.82±0.07 1.14±0.06*1.13±0.08**1.45±0.10**Nephrin 2.06±0.20 1.56±0.15 1.42±0.13*1.17±0.11**Podocin 2.05±0.05 1.79±0.08*1.64±0.06**1.45±0.07**

4 讨论

局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）是由不同病因导致足细胞受到损伤，进一步引起相似肾小球病理改变的一组临床病理综合征。Kindlin家族是一类新发现的黏着斑蛋白，Kindlin不仅在参与了整合素的活化，介导细胞与细胞外基质的黏附作用，而且参与了细胞迁移、细胞增殖和细胞分化的调控[9]。其中Kindlin-2广泛表达于成纤维细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞及内皮细胞等多种细胞。Kindhn-2的缺失不仅可以导致整合素信号通路异常，而且可以导致细胞黏附与细胞支架重组的严重缺陷[10]。已有研究[11]表明，Kindlin-2直接与ILK和migfilin结合，主要定位于细胞与细胞外基质黏附位点，Kindlin-2与migfilin的任何一个下调都能够抑制细胞的延展。目前关于Kindlln-2在肾脏疾病的研究极少，Qu等[5]发现Kindlin-2通过与磷肌醇类、整合素的相互作用而调节足细胞粘附和纤维连接蛋白的沉积，提示Kindlin-2参与了肾小球疾病。Wei等[6]研究表明，在UUO（单侧输尿管梗阻）小鼠模型中，Kindlin-2表达显著上调，敲低Kindlin-2可以有效减轻UUO小鼠的肾脏纤维化。局灶节段肾小球硬化症是一种常见的肾脏足细胞病变，疾病发展终末期，可见明显的肾脏纤维化，但是目前关于Kindlin-2在局灶节段肾小球硬化症的作用研究未有报道，故研究Kindlin-2在局灶节段肾小球硬化症中的作用具有重要意义。

进展性阿霉素肾病模型是经典的FSGS动物模型。本实验利用对肾毒性比较敏感的野生型BALB/C小鼠[12]，通过单次尾静脉注射阿霉素建立经典的局灶节段肾小球硬化症-阿霉素肾病模型。注射阿霉素4周后，模型组小鼠就已经表现为大量蛋白尿，低蛋白血症及高胆固醇血症，符合肾病综合征的临床表现。模型组第4周可见部分肾小球出现局灶、节段硬化，伴有足细胞肿胀；第8周部分肾小球出现球性硬化，伴有明显的足细胞增生和肥大；第12周弥漫性肾小球出现球形硬化，符合FSGS的病理发展特点。WT1是成熟足细胞的特异性标志之一，通常使用WT1免疫组化染色以计数足细胞数量。4周末模型组足细胞数量开始减少，且随着时间的进展，减少的越显著。模型组第4周开始，Kindlin-2 mRNA水平开始上调，且随着时间进展，8、12周肾组织Kindlin-2 mRNA水平明显高于对照组。推测Kindlin-2不仅参与了FSGS早期足细胞损伤的过程，且与FSGS中晚期肾小球硬化及间质纤维化有密切关系，在FSGS整个发病过程中起到了重要作用。Nephrin、Podocin是足细胞裂孔膜上重要的跨膜糖蛋白，在肾小球滤过屏障的形成以及功能维持等方面起着重要作用。模型组第8、12周肾组织nephrin mRNA水平明显低于对照组。模型组第4、8、12周肾组织Podocin mRNA水平明显低于对照组。Kindlin-2mRNA水平与足细胞数量、Nephrin mRNA及Podocin mRNA水平呈显著负相关，表明随着FSGS疾病的进展，Kindlin-2mRNA的水平明显增多，但足细胞的损伤却日益严重。

本实验结果表明，FSGS小鼠模型Kindlin-2表达量逐渐增加，且Kindlin-2与足细胞相关蛋白WT1、Nephrin及Podocin呈现密切负相关，推测Kindlin-2可能通过介导足细胞损伤参与了局灶节段肾小球硬化症小鼠发病过程，在临床工作中通过检测肾脏组织Kindlin-2表达可能有助于预后判断，这将为FSGS的发病机制研究提供实验依据，但具体机制有待进一步研究。