右归饮对骨性关节炎模型大鼠膝关节滑膜细胞自噬和凋亡相关蛋白及血清炎症因子的影响

黄 杨 江浪清 孔劲松 郑 鑫 宫小康 阮建伟 王海宝

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）的主要特点是关节软骨退行性改变。流行病学分析和研究[1]发现，OA的进展与关节的炎性水平密切相关。由关节软骨、关节滑膜，还有软骨下骨中释放的相关因子，引发关节内的炎性反应，可促进凋亡基因的转录，诱发软骨细胞凋亡[2-4]。研究发现细胞自噬表达后，可通过清除细胞内有害及过剩的细胞器和病原体，减少细胞的凋亡，起到保护细胞的作用。中医认为，OA属“骨痹”范畴，以肝肾不足为本，寒湿、痰瘀痹阻经络为标，故治疗时强调补益肝肾。在临床上多用补肾温阳中药治疗OA，但防治干预机制尚不明确。已有研究[5]证实，温阳补肾中药能消除骨痹症中的炎症反应。本研究观察右归饮对OA大鼠膝关节滑膜细胞自噬和凋亡相关蛋白以及血清白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 4周龄雄性Sprague Dawley大鼠30只，体质量（200±20）g，购自中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司，大鼠在浙江中医药大学动物实验中心SPF级动物房中饲养，动物实验条件合格证：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 药 物 右归饮（《景岳全书》），由熟地黄、制附子各 9g，肉桂 3g，山药 6g，山茱萸 3g，枸杞 6g，炙甘草3g，姜杜仲6g组成，经过煎煮、过滤、离心以及浓缩等程序，灌胃时将右归饮细粉溶化至每毫升含生药0.69g，备用。

1.3 试剂及仪器 ELISA试剂盒（批号20170601）购自江苏酶标生物科技公司，免疫印迹检测抗体（批号Bcl-2兔抗 AG04279476、Bax兔抗 AG05085355、Becin-1 兔抗 AF07044415、mTOR 兔抗AF12262669）由北京博奥森生物技术有限公司提供。电泳系统（美国Bio-RAD公司），高压灭菌器（HVP-50，日本HIRAYAMA公司），三孔电热恒温水槽（上海齐欣科学仪器厂），凝胶成像仪（ChemiDoc XRS+System，美国Bio-RAD公司），电动玻璃匀浆机（DY89-Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司）。所有实验均在浙江中医药大学动物实验中心进行。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药 （1）采用随机数字表法将30只雄性SD大鼠分为右归饮组、模型组和空白对照组，每组10只。于动物房中饲养1周后，精确称体质量；（2）右归饮组和模型组大鼠按0.3mL/100g体质量水合氯醛腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，在大鼠的右侧膝关节用Hulth法[6]进行造模：用刀片沿右膝关节内侧纵向切开1.5cm，暴露出内侧副韧带及关节囊，挑断内侧副韧带后，继续钝性分离和松解关节囊，将髌骨推向外侧脱位，暴露并切断前叉韧带，摘除内侧半月板，剪断后交叉韧带，经抽屉实验检查确认造模成功后，复位髌骨，缝合关节囊及皮肤。术后肌注青霉素（4万U/mL）1mL抗感染，连续注射3天。空白组大鼠无任何处理。（3）从造模当日起，对所有大鼠进行正常饲养。在造模后的第4周，对右归饮组大鼠每次10g/kg体质量的右归饮灌胃治疗，同时以模型组和空白对照组大鼠等量的生理盐水灌胃，每天1次，至造模后第8周。

2.2 标本采集 （1）造模结束后第8周，对所有大鼠进行心脏采血，注入抗凝管静置2h后，3000r/min离心20min，将上层血清分离，56℃灭活30min，抽滤除菌后，分装，-20℃低温冰箱中保存备用。（2）大鼠心脏采血后，迅速行手术截取大鼠的右下肢，切开皮肤和皮下筋膜，剥离关节囊，暴露出右膝关节，由关节面上下各1.5cm截骨，获取膝关节组织标本，对每组5只大鼠取其关节滑膜用于本实验的免疫印迹检测。（3）对每组其余5只大鼠的膝关节样本使用10%的磷酸盐缓冲液甲醛固定3天，然后用14%EDTA脱钙4周，石蜡包埋。

2.3 ELISA法检测血清IL-1β、TNF-α及iNOS水平

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）测定各组SD大鼠血清白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平。

2.4 免疫印迹检测关节滑膜自噬与凋亡蛋白表达采用Western-blot检测大鼠膝关节滑膜自噬蛋白Beclin-1、mTOR 和凋亡蛋白 Caspase-3、Bax表达水平。

2.5 膝关节组织标本病理学检测 膝关节标本经过石蜡包埋后，采用HE染色观察软骨形态学改变，Mankin’s评分方法定量分析软骨损伤情况。

2.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异采用两两比较的q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠血清IL-1β、TNF-α和iNOS表达 与空白对照组比较，右归饮组、模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α 和 iNOS水平显著增高（P均＜0.01）；右归饮组大鼠血清IL-1β、TNF-α、iNOS表达水平明显低于模型组（P＜0.01），见表 1。

表 1 各组大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS 水平比较（±s）

表 1 各组大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS 水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；IL-1β：白细胞介素1β；TNF-α：肿瘤坏死因子；iNOS：诱导型一氧化氮合酶

组别空白对照组模型组右归饮组鼠数10 10 10 IL-1β（pg/mL）11.98±1.51 26.76±1.93*20.27±1.41*△TNF-α（pg/mL）89.87±13.54 221.34±19.38*162.63±10.76*△iNOS（U/mL）5.15±0.66 10.13±0.96*7.32±0.48*△

3.2 大鼠膝关节滑膜蛋白表达 与空白对照组比较，右归饮组、模型组大鼠膝关节滑膜Beclin、Bax、Caspase表达量显著增高（P均＜0.01）；右归饮组大鼠膝关节滑膜mTOR和Beclin-1表达量显著高于模型组（P＜0.01），Caspas-3和 Bax表达量显著低于模型组（P＜0.01），见封二图 1、表 2。

3.3 膝关节组织病理学检测 膝关节组织标本经过石蜡包埋后，采用HE染色观察软骨形态学改变，同时采用Mankin’s评分方法[7]定量分析关节软骨损伤情况（见表3），结果发现空白对照组大鼠膝关节软骨基质染色成粉红色，细胞核被染成深蓝色，软骨细胞的排列均匀，潮线结构完整，关节面光滑，层次分明。模型组大鼠膝关节软骨细胞排列紊乱，软骨面有大面积缺损，潮线大量破坏；右归饮组大鼠膝关节软骨表面毛糙，部分潮线破坏，软骨细胞排列尚均匀。Mankin,s评分结果，模型组与右归饮组评分高于空白对照组（P均＜0.01），模型组评分高于右归饮组（P＜0.01）。见封二图 2。

图1 各组大鼠膝关节滑膜蛋白表达

图2 各组大鼠膝关节软骨病理

表 3 各组 Mankin’s评分表（分，±s）

表 3 各组 Mankin’s评分表（分，±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别空白对照组模型组右归饮组鼠数5 5 5 Mankin’s评分0.60±0.55 8.20±0.84*5.20±0.84*△

4 讨论

研究发现，OA关节中炎性因子iNOS、IL-1β、TNF-α等与软骨表面受体结合，从而激活软骨细胞中C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal Kinase，JNK）JNK、核转录因子-kB（nuclear factor-Kappa B，NF-kB）、p38丝裂原化蛋白激酶（mitogen-actirated protein kinase，p38 MAPK）等信号通路[8]，诱导关节软骨释放基质金属蛋白激酶（matrix metalloproteinase，MMPs），破坏软骨细胞外基质的合成与空间正常结构。自噬是真核细胞降解自身成分的一种代谢途径，通过溶酶体机制清除变性的胞浆成分、毒素和病原体，维持细胞的存活和稳态。

mTOR信号通路是目前研究最多的一种自噬调节机制[9]，通过激活mTOR通路启动自噬，而Beclin-1为自噬的相关性蛋白，常常用于检测细胞的自噬水平，可反应自噬水平的高低。自噬在免疫应答中与炎性反应关系密切，研究发现自噬基因Atg16L1的缺乏可导致大量的炎性因子的释放[10-11]。自噬通路及相关蛋白平衡机体免疫和炎症反应产生的利弊效应，增强机体抗感染、自身免疫及炎性等疾病，可以达到保护机体的目的。

右归饮作为补肾温阳的代表方，以温肾阳为主，而阴阳兼顾，肝脾肾并补[12]。OA的中医病机主要是肾阳亏虚，气滞血瘀。临床报道[13-14]血循环瘀滞，血液凝血酶和凝血因子复合物增加，会刺激血管内皮合成和释放 IL-1β、TNF-α、iNOS、IL-6、IL-8、MCP-1、CRP等炎性因子，且炎性因子释放水平与血瘀证呈正相关。本研究发现，右归饮治疗后，大鼠滑膜自噬相关蛋白Beclin-1表达上调，mTOR蛋白表达量下调。同时，凋亡蛋白Bax、Caspase-3含量减少（P均＜0.01），说明右归饮治疗可以诱导大鼠膝关节滑膜自噬表达上调，减少细胞的凋亡。右归饮组大鼠血清IL-1β、TNF-α、iNOS 等炎性因子水平明显降低，而HE染色观察到膝关节面破坏和软骨缺失程度较轻且Mankin评分较低，说明右归饮治疗后大鼠关节内炎性浸润缓解，软骨破坏得到有效的改善。

表2 各组大鼠膝关节滑膜蛋白表达量比较（±s）

表2 各组大鼠膝关节滑膜蛋白表达量比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01;与模型治疗组比较，△P＜0.01；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bax：B细胞淋巴瘤基因-2相关X蛋白；Beclin-1：BECN-1基因编码蛋白；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶

组别空白对照组模型组右归饮组鼠数5 5 5 Caspase-3/GAPDH 0.08±0.02 0.60±0.12*0.25±0.07*△Bax/GAPDH 0.19±0.05 0.79±0.11*0.48±0.14*△Beclin-1/GAPDH 0.26±0.12 0.54±0.08*0.94±0.11*△mTOR/GAPDH 0.49±0.13 0.16±0.09*0.61±0.18*△

本研究结果显示，右归饮可能通过上调自噬的表达，下调膝关节组织中细胞的凋亡，缓解炎性浸润，减轻软骨细胞的破坏。