土茯苓活性分子落新妇苷抗顺铂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡作用研究

姜宣羽 王思为 楼丽君 钟松阳 胡泽富

顺铂是已知最有效的抗肿瘤化疗药物之一[1]，然而其化疗却存在着多种严重不良反应，以肾毒性最为明显，其发生率高达30%以上[2]。研究[3]表明，顺铂化疗肾毒性是影响其抗肿瘤疗效的主要因素。因此降低顺铂化疗肾毒性，是目前亟需解决的问题。顺铂为重金属络合物，其产生肾毒性的原理与重金属肾病相类似，因此一些防治重金属中毒的传统中药可能对顺铂肾毒性有疗效。土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，味甘淡，性平，归肝、胃经，具有健脾胃、解毒化瘀之功效，它也是我国古代治疗重金属中毒的传统中药，其主要活性成分为落新妇苷[4]。研究[5-6]表明，土茯苓中黄酮类化合物具有螯合重金属离子，改善重金属肾损伤的作用。因此，我们推测土茯苓中黄酮类化合物可能具有改善顺铂肾损伤的作用。本研究拟探讨土茯苓活性分子落新妇苷对重金属药物顺铂诱导的人肾小管上皮细胞HK-2凋亡的影响，并初步明确其机制，为土茯苓改善顺铂肾毒性作用研究提供实验依据。

1 实验材料

1.1 材 料 人肾小管上皮细胞HK-2，购自中国科学院细胞库。

1.2 药 物 落新妇苷（来源于土茯苓，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号R1806F4659）；顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，批号160902）。

1.3 主要试剂 MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（博士德生物，货号09I26C56）；AnnexinV-FITC流式细胞凋亡试剂盒（Biolegend，货号640914）；cDNA逆转录试剂盒（Thermo Scientific）；QPCR试剂（上海生工）；bcl-2抗体（CST，货号 4223）；Bax抗体（CST，货号 5023）；cleaved-caspase-3 抗体（CST，货号 9661）；OCT2抗体（Abcam，货号 ab179808）。

1.4 主要仪器 FC-500流式细胞仪，美国Beckman Coulter；MR-4100 型酶标仪，美国 Dynatech；高速冷冻离心机，美国Thermo；LC480荧光定量PCR仪，美国罗氏；4200SF凝胶成像仪，上海Tanon；ECLIPSE Ti-S倒置显微镜，日本Nikon。

2 实验方法

2.1 细胞培养 人肾小管上皮细胞HK-2细胞复苏后，培养于含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM：F12（1:1）培养基中，置于37℃ 5%CO2培养箱，生长密度达80%后，用胰蛋白酶消化，1:3传代培养。选取对数生长期细胞进行实验。

2.2 MTT检测细胞活力 将HK-2细胞用PBS洗涤2次后，胰酶消化，收集细胞，500g 4℃离心3min后弃去上清液，用培养基重悬细胞，并使待测细胞密度为1000～10 000/孔，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，并置于37℃ 5%CO2培养箱中培养。24h后换含有落新妇苷浓度为 30、50、100、200、300μM和顺铂50μM的培养基，每个浓度设6孔。培养24h后每孔加入10μL MTT染色液，于培养箱继续培养4h。后每孔加入100μL Formanzan溶解液，置于摇床上振荡30min，至结晶全部溶解，放入酶标仪（波长490nm）测吸光值。

2.3 流式细胞凋亡检测 取对数生长期细胞接种于6孔板中，分为四组，即对照组、顺铂组、落新妇苷低、高剂量组。待细胞生长至密度为80%左右后，加入不同药物。对照组为正常培养基，顺铂组加入含有浓度为50μM顺铂的培养基，落新妇苷低剂量组加入含有50μM顺铂和100μM落新妇苷的培养基，落新妇苷高剂量组加入含有50μM顺铂和200μM落新妇苷的培养基。培养24h后，用PBS洗涤2次，不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集细胞于EP管，400g 4℃离心3min，弃去上清液，加入200μL Binding-buffer悬浮细胞，后分别加入5μL Annexin-FITC和10μL Propidium-Iodide混匀，室温避光反应10min。最后再加入300μL Binding-buffer，上流式细胞仪检测分析。总凋亡%=早期凋亡%+晚期凋亡%。

2.4 RT-PCR检测 药物处理方法和分组同2.3。采用Trizol法提取各组细胞RNA，并逆转录为cDNA。按照SYBR Green荧光染料法进行定量PCR测定，引物由金唯智公司合成，引物序列如下：OCT2上游引物：5'-CATCGTCACCGAGTTTAACCTG-3'，下游引物 ：5'-AGCCGATACTCATAGAGCCAAT-3'；β -actin上游引物：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，下游 引 物 ：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。PCR反应条件：95℃ 30s 1循环，95℃ 5s 40循环，60℃31s 40循环，采用2-ΔΔCt法进行半定量分析。

2.5 Western blot检测 药物处理方法和分组同2.3。细胞用预冷的PBS洗涤2次后，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解10min后用细胞刮刀刮下，收集于EP 管 ，100℃ 煮 10min 后 16 000r/min，4℃ 离 心10min，取上清液。每组取20μL进行SDS-PAGE电泳分离，转移到硝酸纤维膜上，1%casin封闭1h后加入相应的一抗（bax 1:1000，bcl-2 1:1000，cleaved-Caspase-3 1:1000，OCT2 1:500，β-actin 1:3000），孵育过夜。TBST洗膜5min×4次，与相应的二抗室温孵育1h后，TBST洗膜5min×4次，后用ECL显色液显色，置于凝胶成像仪上拍摄。使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，将目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，得到目的蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法 所有数据均用SPSS17.0统计软件进行处理，数据以（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞活力的影响结果显示，50μM顺铂能够显著抑制HK-2细胞活力（P＜0.01）；落新妇苷具有促进顺铂诱导的HK-2细胞活力的作用，且随着其药物浓度的增加作用越明显，尤其 200μM 剂量显著（P＜0.01）。见表 1。

3.2 落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞凋亡的影响流式细胞凋亡检测结果显示，与对照组比较，顺铂组细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）；与顺铂组比较，落新妇苷能够显著降低HK-2细胞凋亡，尤其200μM剂量组显著（P＜0.01），见封四图 1、表 2。

表1 不同浓度落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞活力的影响（±s）

表1 不同浓度落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞活力的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别对照组顺铂组孔数 落新妇苷（μM）--3 0落新妇苷组6 6 6 6 6 6 6顺铂（μM）-50 50 50 50 50 50 50 100 200 300 OD值（490nm）1.42±0.15 0.96±0.13*1.01±0.11 1.07±0.12 1.15±0.14△1.20±0.13△△1.16±0.17△

表2 各组细胞总凋亡率比较（%，±s）

表2 各组细胞总凋亡率比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别对照组顺铂组落新妇苷组孔数 落新妇苷（μM）6 6 6 6顺铂（μM）-50 50 50--100 200总凋亡率1.20±1.13 61.51±5.67*37.01±6.32△33.52±6.93△△

3.3 落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3 蛋白表达量的影响与对照组比较，顺铂组细胞Bax、cleaved-caspase-3表达量显著增加（P＜0.01），Bcl-2表达量显著减少（P＜0.01）；与顺铂组比较，落新妇苷能够显著下调Bax、cleaved-caspase-3 蛋白表达 （P＜0.05 或 P＜0.01），上调 Bcl-2 蛋白表达（P＜0.05）。见封四图 2、表3。

3.4 落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞药物转运蛋白OCT2 mRNA表达的影响 与顺铂组比较，落新妇苷能够显著抑制HK-2细胞药物转运蛋白OCT2 mRNA（P＜0.01）和蛋白质（P＜0.05，P＜0.01）表达，见封四图 3、表 4。

4 讨论

顺铂抗肿瘤作用的机制主要是通过形成铂-DNA络合物，抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤细胞膜上结构，从而产生细胞毒性[7]，但这也是其产生肾毒性的重要原因。研究[8]表明，线粒体介导的内源性途径、死亡受体介导的外源性途径和内质网应激途径是顺铂引起肾小管细胞凋亡主要途径。Bax和Bcl-2是调控线粒体凋亡途径的主要基因，其比值对细胞凋亡的发生具有决定性作用，而caspase-3是caspase家族蛋白酶的重要组成部分，是凋亡途径中的关键启动因子[9]。研究[3]表明，顺铂能够诱导bax易位到线粒体，促进细胞色素c释放，从而进一步剪切caspase-3，最终导致肾小管上皮细胞凋亡。本研究结果表明，落新妇苷能够显著下调Bax、cleaved-caspase-3，上调bcl-2蛋白表达抑制顺铂诱导的HK-2细胞凋亡。

表3 各组Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白质相对表达量比较（±s）

表3 各组Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白质相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别对照组顺铂组落新妇苷组孔数3 3 3顺铂（μM）-50 50 50落新妇苷（μM）--100 200 Bax表达量0.02±0.01 0.33±0.07*0.19±0.04△0.18±0.02△Bcl-2表达量0.63±0.07 0.11±0.02*0.26±0.04△0.28±0.04△cleaved-caspase-3表达量0.08±0.03 0.54±0.06*0.28±0.06△△0.20±0.05△△

表4 落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞药物转运蛋白OCT2表达的影响（±s）

表4 落新妇苷对顺铂诱导HK-2细胞药物转运蛋白OCT2表达的影响（±s）

注：与顺铂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别对照组顺铂组落新妇苷组孔数 落新妇苷（μM）3 3 3顺铂（μM）-50 50 50--100 200 OCT2 mRNA表达量1.01±0.11 0.89±0.09 0.53±0.14△△0.47±0.03△△OCT2蛋白质表达量0.58±0.05 0.52±0.05 0.36±0.08△0.25±0.03△△

中医认为，顺铂肾毒性属“药毒”范畴，其根本病机为正虚邪盛。顺铂之毒壅积于肾，留聚膀胱，耗伤肾气。“精气夺则虚”，肾气不固，肾精失藏，开合失司，乃至阴精外泄，浊邪内聚[10]。治疗顺铂肾毒性主要以扶正祛邪为治则，采用健脾益肾、活血利水、解毒化瘀等方法[10]。同样现代医学研究显示，顺铂在肾脏的蓄积是其产生肾毒性的基础。顺铂在肾脏的排泄过程中，药物被浓缩，肾脏内高浓度的顺铂被肾小管上皮摄取进入细胞内，顺铂通过与DNA结合引起肾细胞DNA损伤，并诱导其凋亡[8]。因此，减少肾细胞摄取顺铂或促进顺铂排泄是防治顺铂肾毒性最有效的方法。

肾脏中存在大量药物转运蛋白，如有机阴离子转运体（OATs、MRPs、ABCG2和 GLUT9等）和有机阳离子转运体（OCTs、OCTNs、MATEs和 MDR1等），它们在药物的吸收、转运和排泄中起到了关键的作用[11-12]。OCT2即有机阳离子转运体2，它可将血液中多种阳离子物质（如尿酸，重金属离子等）转入肾小管上皮细胞中[13]。临床研究[15]显示，顺铂化疗后药物转运蛋白OCT2基因突变患者肾毒性发生率显著低于野生型患者，这可能是由于OCT2缺失导致转运进入肾小管细胞的顺铂量减少引起的。实验[16]研究也证实，肾小管上皮细胞经OCT2基因敲除后，其摄取铂离子的能力显著降低。本研究结果显示，落新妇苷能够显著降低顺铂诱导HK-2细胞OCT2 mRNA和蛋白质表达（P＜0.05，P＜0.01），提示落新妇苷抗顺铂诱导的HK-2细胞凋亡的作用可能与其抑制OCT2的作用有关。

综上所述，土茯苓活性分子落新妇苷具有抑制顺铂诱导的HK-2细胞凋亡的作用，其机制可能与下调药物转运蛋白OCT2表达有关。