从起点到起点：哺乳动物早期胚胎发育研究进展

刘世超 曲永存 张 莹

（中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室 北京 100101）

0 引言

1961年波兰科学家Tarkowski 在Nature发表了一项开创性的工作，他将不同性别的小鼠8-细胞胚胎通过聚合培养至囊胚期， 并通过体内移植获得具有双性别特征的嵌合小鼠［1］。 这项工作标志着哺乳动物现代胚胎研究工作的起始。 在此之后， 经过全世界科学家半个多世纪的不断探索和发掘， 关于哺乳动物是如何从一个受精卵细胞有组织地发育成为一个完整个体的神秘面纱逐渐开始揭开。在探索过程中衍生出如胚胎干细胞、试管婴儿等开创性的惠及全人类的重大研究成果。2016年英国科学家Magdalena 成功在体外利用干细胞重构出类似体内状态的小鼠早期胚胎， 该论文在国际顶级期刊Science上一经发表就引起了巨大的关注， 这标志着哺乳动物早期胚胎发育的研究已经从对胚胎的探索和认知向着操纵和应用转变， 同时也将哺乳动物胚胎发育的研究推向了一个全新的起点。 2017年Tarkowski 的学生，英国科学家Magdalena 在Science发表了一项令全世界振奋不已的研究成果， 她利用体外培养产生的干细胞，经过人为的重构，获得了类似于体内状态的小鼠早期胚胎［2］。虽然未能产生正常出生的小鼠，但这项工作意味着人类对于生命发生的认知已经跨越了受精过程，又向前迈进了一大步。

从嵌合鼠的出生到人为重构小鼠胚胎的产生， 胚胎发育的研究工作已经逐步从探索和认知向着操纵和应用转变， 同时也将哺乳动物胚胎发育的研究推向了一个全新的起点。 而推动这一领域不断进步的是理论认知的突破和科学技术的革新，更重要的是，这些理论和技术的进步已经在人类再生医学、生殖医疗等方面作出了重大贡献。本文通过介绍哺乳动物胚胎工程和胚胎生物学研究领域的几个标志性成果， 阐述过去几十年间哺乳动物胚胎发育学领域的研究进展及其在人类辅助生殖实践和医疗方面作出的贡献。

1 哺乳动物早期胚胎发育和基本研究方法概述

哺乳动物胚胎发育起始于受精， 精子通过与卵子质膜的融合将父源的遗传信息带入到成熟的卵母细胞中， 在发育生物学中将完成受精的卵母细胞称为受精卵或合子期胚胎。 该由一个细胞组成的胚胎，就像一个压缩包，包含着生物体发育所需的所有信息，在合适的母体环境诱导下，它将这些信息有组织地编辑和释放， 并通过增殖和发育最终形成生物个体。

以小鼠为例， 简述哺乳动物早期胚胎由一个受精卵到三胚层胚胎的发育过程。 在最早期的7个细胞周期（1～128 细胞）中，细胞只分裂不生长，所以在每次分裂后细胞的大小减半（图1）。 伴随着分裂的进行， 小鼠着床前胚胎主要发生2 次重要的形态学改变，在8-细胞期，细胞之间充分接触失去明显的界限，这一过程称为致密化。 在32-细胞早期，一些液体在细胞之间积累，进而在特定位置形成一个液体腔，这时胚胎进入囊胚期。与此同时细胞的空间分布也发生了改变： 在腔的一侧聚集了一团细胞，称为内细胞团；内细胞团和囊胚腔外侧有一层上皮化的细胞包裹着， 这层细胞被称作滋养层细胞。 此时胚胎细胞第1 次发生了可见的组织形态和谱系的分化。

图1 小鼠着床前胚胎发育时程及形态学变化（改编自参考文献［11］）

在之后的2 个细胞周期中， 内细胞团细胞继续进行分化， 其中一部分细胞运动到靠近腔的内表面形成了原始内胚层， 而另一部分覆盖在原始内胚层下的细胞形成了上胚层。 随后上胚层细胞经过复杂的迁移和巨大的形态学转变分化并形成外胚层、中胚层和内胚层。 在随后的发育中，外胚层主要形成表皮和神经系统； 中胚层主要形成真皮、肌肉、骨骼及其他结缔组织和循环系统；内胚层主要形成呼吸道上皮和消化道上皮及由消化道上皮特化而来的各种消化腺。 而之前就已经形成的滋养层和原始内胚层主要参与胎盘的形成。

由于所需环境的特殊性， 直到21 世纪60年代， 早期胚胎发育的研究工作才逐渐摆脱子宫环境的限制，这得益于胚胎体外培养、体外受精、胚胎移植等研究方法的建立。 胚胎体外培养技术是将胚胎从输卵管或子宫内收集， 置于特定的培养基及培养环境中进行培养， 使胚胎在体外生长发育到一定阶段。随着胚胎培养技术的优化和发展，胚胎体外培养已从单一培养、 共培养发展到今天的序贯培养， 能满足早期胚胎的快速生长及变化中不同的代谢需求， 胚胎在体外发育的时间也逐渐被延长。尽管如此，到目前为止人工构建的体外培养体系仍然无法支持哺乳动物着床后的正常发育。 2016年来自剑桥大学的Magdalena 成功将人类体外胚胎培养至13 天， 打破了之前9 天的记录［3］。这项突破能帮助科学家更深入地了解人类胚胎早期发育过程及围植入期的生理学特征。 体外受精是指哺乳动物的精子和卵细胞在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。 胚胎移植是只将胚胎移植到接收状态的母体子宫中的技术。 经过多年的研究和发展，体外受精、体外培养和胚胎移植技术已相当完善。 试管婴儿的出生就是通过将这3 个主要技术相结合而实现的。

2 早期胚胎谱系分化机理的研究及其在胚胎干细胞中的贡献

如果将合子期的胚胎比喻成包含生物体发育所有信息的压缩包， 那么其打开方式就是操控生命发生的关键。 以小鼠为例，直到8-细胞期所有卵裂球之间在形态学上看不到明显的差异。 而在接下来的2 个细胞周期后， 这些细胞就发生了巨大的命运分歧，进而形成滋养层与内细胞团。显然这一分化过程是解压缩的第1 步结果， 因此关于早期胚胎滋养层和内细胞团分化机理的研究也就成为半个世纪以来该领域的一个核心问题。

卵裂球发生明显可见的形态学差异起始于桑椹胚期，此时，由于致密化的产生，卵裂球第1 次发生了内、外位置的区分。 同时，外层卵裂球发生极化，导致一些细胞器和蛋白在卵裂球的顶端（靠近胚胎外侧）和基底面（靠近胚胎内侧）的分布产生差异， 这种差异在接下来16-细胞期至32-细胞期的分裂和发育过程中会进一步导致Hippo 和ROCK 等信号通路在内层和外层细胞间活力的不同［4～6］（图2、图3）。 这会进一步导致转录共激活因子YAP 在外层细胞中入核，从而激活其下游滋养层关键因子如Cdx2 等基因的表达［7］（图3）。而内层细胞由于没有发生极化， 其基因表达谱与外层细胞截然不同，很多与多潜能性相关的基因，例如Oct4、Sox2 和Nanog 等维持高表达水平。 而由于没有YAP 的入核，Cdx2 等滋养层特异性基因在内层细胞不表达。总之，由于极化导致的基因表达差异最终导致了滋养层和内细胞团的分化。值得注意的是，在内细胞团中，多潜能基因的高表达使得其具有了进一步分化和发育成为机体几乎所有细胞的能力， 在体外这也是胚胎干细胞多潜能性维持的分子基础。

图2 小鼠8-细胞期卵裂球极化示意图（改编自参考文献［11］）

图3 极化信号依赖的Hippo 信号通路参与小鼠滋养层与内细胞团分化（改编自参考文献［10］）

理论研究的进展让科学家对于哺乳动物早期胚体滋养层与内细胞团分化机理的理解逐渐深入。而在研究过程中，还有一部分学者将关注点放在是否可以将哺乳动物胚胎细胞像其他细胞一样在体外进行扩增和培养。 最初这一研究的初衷仅仅是对于早期胚胎发育的研究提供一些体外模型，但在之后的研究中其贡献和意义已远超于此。1981年Evans 和Kaufman 首次成功分离与小鼠内细胞团相似的胚胎干细胞系；1998年Tanaka S.首次成功分离与小鼠滋养细胞相似的滋养层干细胞系；2007年Tesar P. J.首次成功分离与小鼠上胚层细胞相似的上胚层干细胞系。在研究过程中，学者发现，无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。 由于它具有体外培养无限增殖、 自我更新和多向分化的特性， 胚胎干细胞作为供体细胞在克隆和转基因动物生产中起到了巨大作用。此外，它的出现也极大推动了细胞治疗技术的进步。近年来，通过改进胚胎干细胞培养体系， 研究人员已经获得了类似小鼠2-细胞卵裂球状态的具有更高发育潜能的胚胎干细胞， 这种细胞不仅可以分化形成机体的所有细胞类型， 还可以分化并贡献到未来形成胎盘的滋养层细胞中。 事实上这些体外培养体系改善的思路， 都参考于同时期体内胚胎细胞所处的分子环境。 虽然干细胞研究领域已经逐渐与发育生物学领域分离，并向着应用方向发展，但在理论上它的产生离不开发育生物学的研究成果，未来其在异种嵌合、 器官再造等方向的应用也离不开哺乳动物早期胚胎发育研究的支持。

3 早期胚胎卵裂球的可塑性与着床前遗传学诊断技术

如果说胚胎干细胞的故事起始于内细胞团，谱系分化的故事则可以追溯到胚胎伊始。 尽管明显可见的分化行为产生于8-细胞期至16-细胞期，但在此之前，早期胚胎卵裂球之间是否存在不可见的、 但可以导致命运分化的差异仍然是学者研究和争论的重点。

人为破坏小鼠2-细胞期胚胎一个卵裂球，在部分胚胎中，剩余的一个卵裂球也可以发育，直至产生出生的胎儿。 同样，在4-细胞期和8-细胞期也具有类似的现象。 这种卵裂球可以适应外界实验干扰并发育形成胎儿的现象称为卵裂球的可塑性，在胚胎水平上称为调整型发育。调整型发育是哺乳动物早期胚胎发育所特有的， 在低等动物胚胎发育过程中， 人为破坏某些卵裂球会导致后代致死或某些特定的组织器官发育缺陷， 这种卵裂球之间的不可替代性称为镶嵌式发育。 也正因如此， 很多学者认为哺乳动物早期胚胎卵裂球之间在命运倾向上不存在差异。

然而也有研究表明，在8-细胞期以前，虽然看不到明显的形态学差异， 但是卵裂球中一些蛋白、RNA 或细胞器等的分布和积累已经产生差异，这种差异被称为卵裂球的异质性。 例如，瘦素和STAT3 在胞质中的分布、组蛋白精氨酸甲基化水平及转录因子SOX2 在细胞核和胞质中的穿梭等，这些因子在4-细胞期4 个卵裂球中的表达量或行为的不同， 会导致这4 个卵裂球后代在囊胚期贡献到滋养层或内细胞团的能力不同。此外，将2-细胞期2 个卵裂球分离后体外培养至囊胚期再移植回体内，结果表明不是所有的2-细胞期单个卵裂球都可以支持发育并产生胎儿， 进一步研究表明2-细胞单个卵裂球发育潜力的差异是由于其在囊胚期产生NANOG 阳性的多潜能细胞个数不同。 在着床前， 只有包含4 个或者4 个以上NANOG 阳性多潜能细胞的囊胚才能发育产生胎儿。与此类似，通过回溯成人体细胞突变至胚胎发育期，研究者发现2-细胞期某一个卵裂球在个体血细胞中的贡献率达到70%， 而另一个只有30%［8］。这些结果说明，早在2-细胞期卵裂球之间就存在可以导致其命运贡献能力不同的异质性。

尽管到目前为止还没有一个完善理论可以解释哺乳动物卵裂球的异质性与可塑性如何共同行使作用调节早期胚胎发育， 关于卵裂球可塑性和异质性的研究已经在辅助生殖领域起到了关键作用。 有报道表明不育症夫妇借助试管婴儿技术产生的胚胎， 由于父母本身及体外操作等原因导致遗传异常的发生机率明显增加。 因此对遗传异常筛查的着床前遗传学诊断非常必要， 具体的做法是在胚胎发育的4-细胞期或8-细胞期取出1～2个卵裂球进行遗传学分析。 而这一方法可行的基础就来自于对于卵裂球可塑性研究的结果， 即从4-细胞胚胎中去除1 个卵裂球或者从8-细胞期胚胎中去除1～2 个卵裂球不影响胚胎发育及胎儿的产生。 目前着床前遗传学诊断技术已在世界广泛应用， 并已在避免试管婴儿遗传疾病方面作出了巨大贡献。

4 嵌合发育与异种嵌合技术

尽管以小鼠为模型的研究工作为哺乳动物早期胚胎发育机理奠定了扎实的基础， 但事实上哺乳动物不同物种间早期胚胎在发育时程、 胚胎运动和组织方式上都存在着巨大的差异。 哺乳动物不同物种或者仅仅是相同物种不同基因型的胚胎发育兼容性有多大， 胚胎的自我调整能力到底有多强，一直以来都是发育生物学的重要研究问题。基于对这些问题的关注， 发育生物学领域首先在哺乳动物发育过程中提出了嵌合发育， 并通过体外胚胎操作技术首次实现黑白花色和双性别特征嵌合小鼠的生产。

嵌合体指的是不同遗传背景或者性状混杂表现的个体。在发育生物学领域指的是由不同遗传背景的细胞组成的生物性状混杂嵌合的个体。如前文所述，种内不同个体早期胚胎细胞聚合可以产生嵌合体，这说明相同物种不同基因型的胚胎发育具有兼容性。 此外，大鼠和小鼠2 个不同属的物种之间也实现了嵌合发育， 并产生了胰脏补偿的嵌合个体。 但是由于理论认知和技术支持的不足，目前绝大多数物种间无法实现嵌合发育，也不能产生嵌合个体。这说明，至少在目前的研究水平上，大多数哺乳动物不同物种间早期胚胎发育不具有兼容性。而在发育过程中，不同遗传背景的细胞如何相互合作和竞争最终贡献到嵌合个体中目前也不清楚。

与理论研究进展不同的是， 在应用领域嵌合技术在飞速发展并得到了广泛的关注。 1968年Gardner R. L.建立了囊胚腔内注射的嵌合方法，并且生产出嵌合小鼠。 Evans 和Martin 等应用这一方法， 将胚胎干细胞注射到小鼠囊胚腔中生产出嵌合小鼠。从此，以胚胎干细胞为工具通过囊胚注射的方法生产转基因小鼠逐渐成为转基因动物生产最主要的方式。2006年日本科学家山中伸弥成功将体细胞诱导产生诱导多能干细胞（iPS 细胞），并以此研究成果获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。异种嵌合与iPS 技术的结合为异种器官再造点燃了希望。 将器官病变患者的皮肤细胞在体外诱导成为iPS 细胞，进一步将这些细胞注射到器官敲除猪的囊胚中， 就有可能利用猪生产出完全来源于患者细胞的器官。 2017年初美国科学家Belmonte 在世界顶级杂志Cell发表了利用多潜能干细胞实现了人猪异种嵌合胚胎的生产， 并且获得了体内发育3～4 周的嵌合胎儿［9］。这项研究再次点燃了嵌合体的研究工作， 相信不久的未来在发育生物学领域关于嵌合发育的研究工作将会产生更多的成果以支持其在再生医学领域的应用。

5 总结和展望

回顾半个多世纪以来早期胚胎发育的研究工作成绩卓越； 在理论上极大地扩展了人们对于哺乳动物生命由来的认知， 在实际应用上直接促进了干细胞治疗技术和辅助生殖技术的产生。今天，站在新的起点上， 哺乳动物早期胚胎发育研究工作仍然面临着巨大的挑战； 在理论上如何将调整型发育与镶嵌型发育统一， 寻找到生命解压缩的真正路径？在实际应用上能否跨越受精过程，在体外人工构建具有发育能力的胚胎？可以预见，在未来， 早期胚胎发育研究领域的突破将会直接促进器官再造、 太空胚胎和体外妊娠等惠及全人类生育和健康的重要科学技术的实现。