大湘西野生猕猴桃酿酒酵母的分离鉴定及其产物ACE抑制活性

伍 强万 常彭娟娟曾 豪余有贵

(1. 邵阳学院食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000；2. 邵阳市酿酒工程技术研究中心，湖南 邵阳 422000)

猕猴桃果酒除含一定乙醇外，还富含各种氨基酸、肽类及糖类、VC等成分，具有预防心脑血管疾病、抗氧化、抗菌消炎等保健功效[1]，但该功效究竟与哪些活性成分有关，目前尚未得到表征。

ACE抑制肽是一类具潜在降血压功效的小分子物质，具备安全高效、人体易吸收等优点。关于食物中本身存在的天然ACE抑制肽研究甚少，通常采用定向酶解技术制备食源性小肽[2]。目前，已有研究发现利用微生物制成的发酵产品中含有活性较强的天然ACE抑制肽，其中Kleekayai等[3]发现经传统自然发酵法制成的泰国虾酱中含有2种ACE抑制肽(Ser-Val和Ile-Phe)；Wang等[4]利用纳豆芽孢杆菌发酵豆粕获得ACE抑制肽，测得其活性IC50为22 μg/mL；Nejati等[5]接种乳酸乳球菌DIBCA2制成发酵乳，获得IC50为5 μg/mL 的ACE抑制肽；Wang等[6]发现经霉菌发酵生产的豆豉中富含ACE抑制肽，并指出霉菌发酵过程中发生的美拉德反应影响ACE抑制活性，目前国内外尚未见果酒ACE抑制肽的研究报道。

本研究拟以大湘西野生猕猴桃为菌种分离源，通过分离筛选和分子生物学鉴定，旨在获得一株适用于猕猴桃果酒发酵的优势野生酵母菌，并初步研究该菌株纯种发酵过程中ACE抑制活性、多肽浓度及酒精度的动态变化，为开发大湘西野生猕猴桃降血压型保健果酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

酵母菌分离源：湖南邵阳绥宁野生猕猴桃；

对照菌株：安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司；

酵母26S rRNA基因D1/D2区序列扩增引物NL-1(5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3＇)、NL-4(5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇)：北京六合华大基因有限公司；

CTAB、TE、蛋白酶K、PCR缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶：北京宝杰罗生物科技有限公司；

果胶酶：酶活50 000 U/g，河南华悦化工产品有限公司；

培养基所有试剂均为分析纯。

1.2 培养基

分离培养基：YEPD培养基[7]；

WL培养基：葡萄糖50 g，溴甲酚绿0.022 g，磷酸二氢钾0.55 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化钾0.425 g，酵母浸粉4.0 g，硫酸镁0.125 g，硫酸锰0.002 5 g，氯化铁0.002 5 g，氯化钙0.125 g，琼脂20.0 g，用蒸馏水定容至1 L，pH为6.5，高温121 ℃灭菌20 min[8]；

猕猴桃培养基：选八成熟、发软的野生猕猴桃，清洗干净，打浆，加入0.10 g/100 g果胶酶搅拌均匀，在35 ℃酶解3 h，取上清液于68 ℃灭菌20 min。

1.3 主要仪器设备

单人单面垂直净化工作台：SW-CJ-1FD型，苏州博莱尔净化设备有限公司；

数码显微镜：BA310型，麦克奥迪(厦门)实业集团有限公司；

打浆机：JYL-C012型，九阳股份有限公司；

pH计：EL20型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1780型，日本岛津仪器有限公司；

高压灭菌锅：JI54DWS型，致微(厦门)仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分离 根据柴洋洋等[9]的方法修改如下：无菌称取10 g新鲜的野生猕猴桃，置于无菌研钵中研成果浆，转移至装有90 mL无菌水的三角瓶，混合均匀后置于28 ℃ 培养24 h。以无菌水对该浆液进行梯度稀释，吸取10-1稀释液2 μL涂布于YEPD分离培养基上，于28 ℃培养3 d。挑选典型的酵母单菌落平板划线，继代2次获得纯化菌种，用JM1、JM2、JM3、……依次编号，观察菌落形态特征。

1.4.2 酿酒酵母的筛选 挑选YEPD分离培养基上具有单菌落、表面光滑突起、呈奶油色的菌株，在10×80倍显微镜下镜检，观察细胞的形态特征，对多端出芽繁殖的酵母菌株进行初筛。

采用WL培养基从初筛的酵母菌株中筛选出酿酒酵母[8]，将酵母菌株分别划线接种于WL培养基，28 ℃培养5 d 后，选择颜色为乳白色、球形突起、表面光滑不透明、平板上有酒香的菌株。

将筛选的酿酒酵母活化后，以3 mL/100 mL接种量(种子液浓度1.0×108个/mL)接种于猕猴桃培养基上，调整起始pH为3.6，起始糖度160 g/L，于28 ℃发酵72 h，测定发酵醪液的ACE抑制活性及酒精度，以安琪果酒酵母作为对照，筛选出发酵能力较强并具有ACE抑制活性的酿酒酵母。

1.4.3 酵母菌的分子生物学鉴定 根据牛广财等[10]的方法修改如下：取纯化菌株于研钵中液氮研磨，加入600 μL TE充分悬浮菌体，加入10% SDS 250 μL，倒转混匀后加入20 ng/μL 蛋白酶K 3 μL，于37 ℃水浴1 h。依次加入5 mol/L NaCl 150 μL、2% CTAB 150 μL，于65 ℃水浴20 min。12 000 r/min离心20 min，取上清液加入等体积异丙醇，放置30 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取沉淀加入70%酒精750 μL，充分悬浮后12 000 r/min、4 ℃离心2 min，取沉淀加入30 μL(含Rnase，10 ng/μL)，4 ℃溶解过夜。PCR扩增条件：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。反应体系(30 μL)：Taq聚合酶(5 U/L)0.2 μL，PCR缓冲液3 μL，dNTP混合液(25 mmol/L)2 μL，引物NL-1(10 mol/L)3 μL，引物NL-4(10 mol/L)3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O定容至30 μL。将PCR产物送至北京六合华大基因有限公司进行26S rDNA D1/D2测序，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列比对(BLAST)。

1.4.4 发酵醪液的ACE抑制活性 将分离筛选获得的酿酒酵母接种于猕猴桃培养基，调整起始糖度为160 g/L，起始pH为3.6，在28 ℃下进行纯种发酵。分别在不同发酵阶段(0，2，4，6，8，10 d)取100 mL发酵醪液，根据余有贵等[11]的方法，采用密度仪测定其酒精度。4 000 r/min离心15 min，测定发酵醪液上清液的ACE抑制率和多肽浓度。

1.4.5 ACE抑制率的测定 参照Wu等[12]的方法。

1.4.6 多肽浓度的测定 根据Wu等[13]的方法修改如下：将发酵醪液上清液与10 g/100 mL的三氯乙酸(TCA)水溶液等体积混合后静置10 min，在4 000 r/min下离心15 min，取上清液用福林—酚法测定吸光值，计算多肽浓度。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离纯化与筛选

经初步分离，获得12株符合条件的酵母菌菌株，分别标记为JM1～JM12。如表1所示，通过菌落形态观察和细胞形态镜检，发现JM1、JM2、JM3、JM4、JM5、JM6、JM11、JM12菌落均呈白色，显微镜下观察细胞多呈圆形、椭圆形，其中JM1、JM11、JM12菌落较大、呈奶白色、表面光滑突起[图1(a)]，细胞呈圆形[图1(b)]。利用WL培养基对8株菌株作进一步筛选，发现其菌落形态差异明显，JM1、JM11、JM12菌落呈乳白色、球形突起、表面光滑不透明[图1(c)]，平板上有酒香，将其初步拟定为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；JM2、JM3菌落中央呈深绿色、边缘呈淡绿色，扁平、表面光滑不透明，呈黄油状，属于葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)；JM4、JM5、JM6菌落呈鲜绿色，菌落很小、表面光滑不透明、呈黄油状，属于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyccspombe)。

表1 野生猕猴桃酵母菌的分离筛选Table 1 Isolation and screening of yeast strains from wild kiwifruit

图1 野生猕猴桃酿酒酵母菌JM11的形态特征

图1 Morphological characteristics ofSaccharomycescerevisiaeJM11 from wild kiwifruit

选取JM1、JM11、JM12对猕猴桃培养基进行发酵，比较三者的产酒量及ACE抑制活性，发现JM11发酵醪液的酒精度最高(5.6%Vol)，ACE抑制率较强(69.4%)。对JM11作进一步分子生物学鉴定，以验证该野生酵母菌为酿酒酵母。

2.2 酿酒酵母的分子生物学鉴定

利用引物NL-1与NL-4对该酿酒酵母26S rDNA基因序列进行PCR扩增，如图2所示，琼脂糖凝胶电泳显示该扩增产物的分子量约为550 bp。

野生猕猴桃酵母菌JM11的DNA测序结果如图3所示，将该序列提交至GenBank核酸序列数据库进行序列比对，发现该菌株与Saccharomycescerevisiae(MG547774.1)序列相似性最高，为90%。结合该菌株的YEPD培养基、WL培养基等菌落特征和显微镜细胞形态观察，确定所筛选的野生猕猴桃酵母菌JM11属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

M. 标准Maker JM11. PCR产物图2 野生猕猴桃酿酒酵母菌JM11的PCR产物电泳图

图2 Electrophoretogram of PCR product ofSaccharomycescerevisiaeJM11 from wild kiwifruit

2.3 酿酒酵母发酵醪液的ACE抑制活性

如图4所示，随着野生猕猴桃酿酒酵母纯种发酵的进行，该发酵醪液中多肽浓度呈先上升后下降的趋势，ACE抑制率则先上升后趋于平缓。酒精度不断上升，尽管在第6天时酒精度高达9.5%Vol，但在发酵第4天时，ACE抑制率由发酵前的32.6%上升至93.0%，多肽浓度也达到最高值(2 652.0 μg/mL)，说明在野生猕猴桃经自然发酵后产生了活性较强的ACE抑制剂，其活性高于箭鱼鱼卵[14]、墨鱼[15]、鸭皮[16]等食源性ACE抑制剂。

真菌在生长过程中可分泌蛋白酶，将蛋白质降解为氨基酸或短肽[17]。酵母为适应环境变化，胞内会出现应激蛋白，与此同时也会分泌胞外蛋白作为一种信号载体或分泌蛋白酶来应对环境的变化[18]，酿酒酵母[19]和纯生啤酒酵母[20]在特定发酵条件下可分泌蛋白酶A酶原、蛋白酶A。因此，本研究推测在该发酵过程中野生酵母菌分泌蛋白酶，降解猕猴桃果肉蛋白，从而产生ACE抑制活性较强的肽类物质。为证实推测，后期课题组将进一步对发酵醪液中可能存在的ACE抑制肽进行分离纯化，并研究该活性肽在野生猕猴桃纯种发酵过程中的形成机理。

图3 野生猕猴桃酵母菌JM11基因序列Figure 3 Nucleotide sequence of yeas JM11 from kiwifruit

图4 野生猕猴桃不同发酵阶段醪液中ACE抑制活性的测定

图4 Determination of ACE inhibitory activity of wine fermentation liquor of wild kiwifruit

3 结论

利用平板划线、YEPD培养基、WL培养基及显微镜观察对野生猕猴桃酵母菌进行分离筛选及初步鉴定，发现野生猕猴桃酵母菌共有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、路氏类酵母(Saccharomycordesludwoggi)、红酵母(Rhodotorular)、全美梅氏酵母(Metschnicowiapulcherrima)5类，分别编号为JM1～JM12，其中JM1、JM11、JM12被鉴定为酿酒酵母。利用ACE抑制活性、酒精度等指标对酵母菌JM1、JM11、JM12作进一步筛选，发现JM11发酵醪液表现出较强的ACE抑制活性，并测得酒精度为5.6%Vol，经26S rDNA D1/D2区序列分析，确定野生猕猴桃酵母菌JM11为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。利用酵母菌JM11对野生猕猴桃进行纯种发酵，发现该发酵过程中产生了活性较强的ACE抑制剂，该物质是否为ACE抑制肽，仍有待进一步确认。