远志助眠功效成分提取及分析

陈丽欢 徐德平 孔佳美 姚明华 张 东 古丽拜克热木 高静秋

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

远志又名细叶远志，是可用于保健食品的中药[1]，具有安神、祛痰、消肿等多种功效[2]。据报道[3]，远志主要成分为皂苷，此外还包括糖、哐山酮类、香豆素等多类化合物。有研究[4-8]表明，生远志高剂量能协同戊巴比妥钠呈现明显的催眠作用，同时也证明[9]中枢系统中，单胺类递质如多巴胺、5-羟色胺等在睡眠调节中起着重要的作用。但未有关于远志起助眠作用的具体物质以及作用机制的研究。

本试验从远志药材的提取分离拟对远志醇提物的不同萃取物助眠作用进行研究，并通过直接睡眠法和分析小鼠海马区多巴胺含量的变化得到远志助眠的功效物质；通过HPLC-MS和NMR对该物质进行结构鉴定，为远志进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

远志：产地山西；

ICR 小鼠：18～22 g，南京模式动物研究所；

DA标准品：美国Sigma公司；

硅胶板：GF254，山东烟台芝罘化工厂；

Octadecylsilyl(ODS)填料：北京绿百草科技发展有限公司；

Middle Chromatogram Isolated Gel( MCI )填料：三菱化学控股集团；

丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇、磷酸氢二钠：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 试验仪器

萃取罐：RAT-100 型，上海锦赋实验仪器设备有限公司；

旋转蒸发器：XHRE-1002型，广州予华仪器有限公司；

摄像头：LS-Q130W-1型，广东东莞市盛鼎电子科技有限公司；

恒流泵：SYB106-100 型，天津市科器高新技术公司；

暗箱式紫外透射仪：ZF-90 型，上海顾村电光仪器厂；

可见分光光度计：V-5100B 型，上海元析仪器有限公司；

自动部分收集器：BS-160ABS-160A 型，上海金鹏分析仪器有限公司；

超声波清洗器：FRQ-1002T 型，杭州法兰特超声波有限公司；

高效液相色谱仪(紫外+荧光检测器)(反相)：1525型，美国沃特世公司；

液质联用仪：MALDI SYNAPT MS 型，美国沃特世公司；

核磁共振仪：Avance 500 MHz型，美国Bruker 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理 将20 kg远志粉碎，过30目筛后，放入体积为100 L的提取罐中，按料液比1∶10 (g/mL)加入75%的乙醇，60 ℃搅拌提取3 h，取上清液后，渣重复提取2次。将3次所得上清液浓缩后得远志乙醇提取物。将乙醇提取物和去离子水1∶1 (g/mL)混合后，依次用相同体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、浓缩后得石油醚萃取物(Ⅰ)、乙酸乙酯萃取物(Ⅱ)、正丁醇萃取物(Ⅲ)以及萃余物(Ⅳ)，于-18 ℃保存备用。

1.2.2 远志醇提物不同溶剂萃取物的助眠作用 取50只ICR小鼠，10只/组，共5组，分别进行灌胃。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4组试验小鼠的灌胃剂量均为1 g/kg·BW，对照组给等量生理盐水，1次/d。1周后，观察灌胃30 min内小鼠的睡眠率、灌胃结束后12 h内小鼠的睡眠时间。

1.2.3 乙酸乙酯萃取物的分离 将远志醇提物的乙酸乙酯萃取物上MCI(5 cm×100 cm)柱，依次用不同体积分数的乙醇溶液(30%，50%，70%，95%)洗脱，通过薄层色谱法(TLC)检测洗脱液中的成分，根据TLC检测结果合并相同成分的洗脱液，分成A(30%洗脱)、B(50%洗脱)、C(70%洗脱)、D(95%洗脱)4个部分。将其分别减压浓缩，于-18 ℃保存备用。

1.2.4 乙酸乙酯萃取物不同分离组分的助眠效果 取50只ICR小鼠，10只/组，共5组，分别给药灌胃。A、B、C、D 4组小鼠的剂量为500 mg/kg·BW，对照组(CK)小鼠给等量生理盐水，1次/d。1周后，观察灌胃30 min内小鼠的睡眠率、灌胃结束后12 h内小鼠的睡眠时间。

1.2.5 测定脑组织多巴胺含量

(1) 制备匀浆：使用异弗烷麻醉小鼠后进行经心灌注。将小鼠断头处死，迅速剥取全脑，置冰盘中，分离出小鼠左、右海马区，-80 ℃冰冻保存备用[9]。

称取海马区0.2 g，加入0.1 mol/L的高氯酸300 μL后置于冰盘上碾碎1 min。以15 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，进样分析[10]。

(2) 色谱条件：根据文献[11]修改如下，pH 3.0；流速1.0 mL/min；检测波长280～320 nm；柱温10 ℃；进样量15 μL。

1.2.6 远志助眠活性部位的成分分离 将1.2.4中助眠效果好的组分减压浓缩后上样到MCI 柱(5 cm× 100 cm)，依次用不同体积分数的乙醇洗脱，薄层色谱层析法检测洗脱液中的成分，并根据结果将相同成分合并，浓缩后重复过MCI(5 cm×100 cm)柱，得到主要成分的较纯化合物A。

1.2.7 远志助眠活性部位的成分检测

(1) 发泡性试验：皂苷能降低水溶液表面张力，产生的泡沫不因加热而消失[12]。取0.5 g化合物A，加水5 mL溶解，煮沸10 min后滤出水溶液。

(2) 氯仿-硫酸反应：取0.5 g样品溶于氯仿，加入浓硫酸后分层，氯仿层呈红色，硫酸层显绿色荧光。通过上述现象则可判断为皂苷。

(3) Lieberman-Burchard反应：将试样溶于氯仿，加入浓硫酸-乙酐(1∶20)数滴，呈黄→红→蓝→紫→绿色的变化后，观察最后的成色。

(4) 结构检测：使用液质联用仪(HPLC-MS)推断样品的结构成分。

HPLC-MS检测条件：检测波长200～400 nm；分析柱为BEHC18柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸洗脱40 min → 乙腈和0.1%甲酸混合液(体积比3∶7)洗脱45 min → 乙腈和0.1%甲酸混合液(体积比8∶2)洗脱50 min → 100%乙腈洗脱55 min → 0.1%甲酸洗脱35 min；柱温45 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。

(5) 核磁共振分析：以二甲基亚砜-d6(DMS-d6)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标物，将得到的化合物经氢谱和碳谱等光谱数据分析，确定其结构。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 22.0进行分析。组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 远志醇提物的不同溶剂萃取物的助眠作用

由表1可知，在不同溶液的萃取物中，远志乙酸乙酯萃取物的试验小鼠睡眠率、睡眠时间均为最佳，助眠效果最显著，且与空白小鼠存在显著性差异(P<0.01)；远志正丁醇萃取物试验小鼠的睡眠时间与空白小鼠也有显著性差异(P<0.05)，但明显低于乙酸乙酯萃取物的小鼠睡眠时间。

试验中远志醇提物不同溶剂萃取物明显延长各组小鼠睡眠时间和睡眠率的现象，与北五味子多糖[13]能够显著延长小鼠睡眠时间的现象一致，由此推断远志醇提物有助眠作用，且有效成分为远志醇提物乙酸乙酯萃取物。

2.2 乙酸乙酯萃取物不同组分对小鼠的助眠作用

由表2可知，远志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脱物的试验小鼠的睡眠率最高，为80%，同时平均睡眠时间最长，为509.6 min，且明显高于其他各组的，同时具有显著性差异(P<0.05)。

表1 不同萃取物对小鼠睡眠率和时间的影响†Table 1 Influence of extracts on sleep rate and time of mice

† a. 与对照组相比在P<0.05水平差异显著；b. 与对照组相比在P<0.01水平差异显著。

† a. 与对照组相比在P<0.05水平差异显著；b. 与对照组相比在P<0.01水平差异显著。

分析图1，组别为远志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脱物的小鼠海马区DA含量最高，与空白组相比效果最明显(P<0.01)。组别为远志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱20%乙醇洗脱物、50%乙醇洗脱物、95%乙醇洗脱物的小鼠海马区DA含量与空白组相比差异显著(P<0.05)，明显低于远志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脱物的试验组小鼠海马区DA含量，同时具有显著性差异(P<0.05)。

睡眠是中枢神经系统发生的一个主动过程，与脑内神经递质，尤其是单胺类递质，如多巴胺、五羟色胺的动态变化有着极大的关联，DA作为中枢神经递质中最重要的组成部分，在睡眠-觉醒过程中起着极其重要的作用[9, 14-16]。因此，组别为远志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脱物的小鼠海马区DA含量的显著提高有利于该组小鼠睡眠率的提高、睡眠时间的延长，故推断该部分为远志助眠的功效部位。

a. 与空白对照组比较在P<0.05水平差异显著；b. 与空白对照组比较在P<0.01水平差异显著

图1 不同组别小鼠海马区中多巴胺(DA)的积分峰面积

图1 The peak areas of dopamine in different groups of mouse hippocampus region

综合表2和图1可知，远志醇提物乙酸乙酯萃取物中具有助眠作用的功效成分主要集中在MCI柱70%乙醇洗脱物中。

2.3 乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脱部分成分纯化及分析

2.3.1 远志助眠活性成分的理化分析 70%乙醇洗脱部分具有很好的助眠作用，分离后得一个单体化合物A，其理化检测结果见表3。

从表3可知，单体化合物A的各项理化检测均呈现皂苷具有的性质，故推断该化合物为皂苷类物质。

表3 各项检测结果及其分析Table 3 Results and inferences of different physical tests and chemical analysis

2.3.2 HPLC-MS检测 图2为HPLC图谱，图3～5为主要化合物的质谱图。

图2中主要有3个峰，即该部分主要有3种化合物组成，含量最多的化合物保留时间为6.99 min(图5)，其与保留时间为6.93 min(图4)的化合物为同分异构体，对应的分子量均为1 573，由于分子量为奇数，可以推断化合物含有氮。

2.3.3 核磁共振分析 化合物A的13C-NMR和135dept图谱见图6。从图6中可以看出化合物A不纯，结合HPLC-MS检测可以看出该组分含有2个同分异构体，使用常规的色谱方法难以将其分离。但图6(a)中可以看出在化学位移为20～60时，有明显的皂苷信号，但为何种皂苷无法确定，同时也可看出在化学位移为60～105时有3个糖残基，说明化合物含有1个由3个糖组成的糖链，其详细结构还在继续研究中。

图2 MCI柱70%乙醇洗脱物液相色谱图Figure 2 The chromatography of elution fraction of 70% ethanol in MCI in HPLC

图3 保留时间为6.76 min化合物的质谱图Figure 3 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.76 min

图4 保留时间为6.93 min化合物的质谱图Figure 4 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.93 min

图5 保留时间为6.99 min化合物的质谱图Figure 5 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.99 min

图6 化合物A的13C-NMR和135dept图谱Figure 6 13C-NMR spectrum and 135dept spectrum of A

3 结论

本试验结果表明，远志助眠功效部位为远志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脱物；经分离纯化后所得的较纯化合物A为2个互为同分异构体的皂苷类物质，该物质分子量为1 573，且含有氮元素和1个由3个糖组成的糖链。本研究为远志功能成分的开发提供了依据。但化合物A的具体结构仍需进一步研究。