急性呼吸道感染患儿中检出B1基因亚型人偏肺病毒

范国权 刘晓莉 蔚京京

急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)是儿科门诊和住院的常见病,病毒是儿童ARI的主要病原。多数儿童ARI由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、流感病毒(influenza virus)、副流感病毒(parainfluenza paramyxovirus)、冠状病毒(coronavirus,CoV)、肠道病毒(enterovirus,EV)、腺病毒(adenovirus,ADV)、鼻病毒(rhinovirus)引起,除此以外尚有一部分儿童ARI的病原学原因不明确［1-2］。近年来报道人类细小病毒(human parvovirus)［3］、人偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)［4］也是引起儿童ARI的重要病原,可以解释部分不明原因儿童ARI的病因。

近年来,我国部分地区在儿童ARI患者中相继检出HMPV和人细小病毒［5-6］,证实这2种病毒也是引起国内儿童ARI的病原。目前的资料显示国内较多地区在儿童ARI患者中检出HMPV,显示HMPV可能是我国儿童ARI的常见病原［7-9］。山西省尚未开展HMPV病原学、流行病学等方面的研究。本研究在山西省太原市 ARI患者中检测到HMPV并对其进行分型研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2007年1月1日至12月31日到山西省儿童医院呼吸科治疗的儿童ARI患者,选择年龄1～5岁并且在太原市居住的患儿采集鼻咽洗液,每个季度各采集25份标本。标本采集后暂时在-20℃冰箱冻存,1周内送山西医科大学微生物和免疫教研室检测。本研究获得山西医科大学伦理委员会批准,标本采集经患儿家属知情同意。

1.2 核酸提取和病毒基因扩增 采用Qiagen公司的QIAamp Viral Minikit试剂盒从鼻咽洗液中提取RNA。随机六聚体引物pd(N)6购自TaKaRa公司,稀释至20 pmol/μl备用。逆转录试剂采用美国Amersham Biosciences公司的Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads试剂盒。核酸提取和逆转录依据试剂盒操作说明进行。

取RNA样品 30 μl加入无 RNA酶离心管,65℃ 10 min,冰浴2 min,短暂离心；吸出25 μl RNA样品转移至cDNA合成反应管内,避免混悬；加入1 μl稀释好的随机六聚体引物pd(N)6和7 μl DEPC处理的水,使最终容量达到33 μl,室温静置约1 min；轻轻混悬或反复吹打,混匀管内成分,短暂离心；37℃水浴60 min,合成的cDNA直接进行聚合酶链式扩增(polymerase chain reaction,PCR)。

HMPV核蛋白(nucleoprotein,N)基因扩增引物为 Nup/Ndown［10］,其中上游引物 Nup 序列为 5′-ATGGGACAAGTGAAAATGTC-3′,下游引物 Ndown序列为 5′-GCATTT(G)CCGAGAACAACAAC-3′,预期扩增产物长度982 bp。由上海生工生物技术有限公司合成,稀释至20 pmol/μl备用。PCR反应条件为95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 45 s,共35个循环；72℃ 5 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 病毒基因序列测定与系统进化分析 PCR产物核酸序列测定由北京华大基因有限公司完成。核酸序列拼接采用ATGC和DNAStar中的Seqman软件,核酸序列推导氨基酸序列采用DNAStar中的EditSequence软件,核酸和氨基酸序列在NCBI网站进行BLAST比对,采用ClustalW1.83进行序列比对,采用 MEG3.1软件以邻接法(Neibour-joining Method)对N基因序列进行系统进化分析,Bootstrap值设定为1 000。

2 结果

2.1 N基因扩增 100份标本全部提取RNA,以随机引物逆转录制备cDNA,以引物Nup/Ndown进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测显示从2月份采集的1份标本和11月份采集的2份标本中扩增到大小约1 000 bp的条带,其余标本未扩增到大小符合预期的PCR产物。2月份的1份标本来自1名3岁男童(标本编号SY0702M13),11月份的2份标本中1份来自1名1岁6月龄男童(标本编号SY07 11M06),另1份来自1名2岁女童(标本编号SY07 11F09),3名儿童均以 ARI就诊治疗。上述RTPCR结果提示这3份标本可能为HPMV阳性标本。2.2 核酸序列测定与比对 序列测定结果显示PCR扩增产物全长982 bp,符合Nup/Ndown引物预期扩增产物大小。以标本编号代表所测定核酸序列,将获得的核酸序列在NCBI网站进行BLASTn比对,结果显示与HMPV同源性＞83%；其推导氨基酸序列进行BLASTx比对,结果显示与HMPV同源性＞90%；所测定核酸序列相互间同源性＞98%。上述结果高度提示这3份标本中的HMPV为同一基因型HMPV。

2.3 N基因系统进化分析 收集GenBank中代表性HMPV N基因核酸序列,与SY0702M13、SY0711M06、SY0711F09标本N基因核酸序列共同进行系统进化分析,结果显示所有的HMPV分为A、B两个基因型,A基因型内又分为A1、A2基因亚型,B基因型内又分为B1、B2基因亚型。本研究测定的HMPV SY0702M13、SY0711M06、SY0711F09 均位于 B1 基因亚型分枝内,与日本HMPVJPS03-194最接近(图1)。因此,本研究中检出的为HMPV B1基因亚型。

3 讨论

图1 人偏肺病毒核蛋白基因系统进化分析∗:Sequences of nucleoprotein genes of human metapneumoviruses in this study； A,B:genotype； A1,A2,B1,B2:subgenotype；The GenBank sequence number and the country of origin in parentheses；The Bootstrap value is set to 1 000Fig.1 Phylogenetic analysis of nucleoprotein genes of human metapneumoviruses

HMPV属于副粘病毒科(Paramyxovirinae)肺病毒亚科(Pneumovirinae)偏肺病毒属(Metapneumovirus),有A、B两个基因型,A基因型内有A1、A2基因亚型,B基因型内有B1、B2基因亚型,是世界范围内引起儿童ARI的重要病原体［10］。国内持续在儿童ARI患者中检出HMPV,证实HMPV在国内分布范围较广,是国内儿童ARI的重要病原体［7-9］。HMPV主要侵犯5岁以内的低龄儿童,感染无性别差异,主要在当年10月份到第2年5月期间流行,但是因地域不同而在流行期限和流行高峰期上有所不同［10］。此次检出HMPV的3份标本中1份来自2月份的儿童ARI患者,2份来自11月份的儿童ARI患者,3名患儿年龄都低于3岁。

首都儿科研究所对2002年11月到2003年3月采集的247份排除常见呼吸道病毒所致ARI住院患儿鼻咽洗液标本进行HMPV N基因扩增,有74份标本检出HMPV,检出率30%［11］；上海市儿童医院对2004年8月到2005年1月采集的259份排除常见呼吸道病毒所致ARI住院患儿鼻咽洗液标本进行 HMPV M基因扩增,有59份标本中检出HMPV,检出率22.8%［12］。此次在2017年全年采集的100份没有提前排除过常见呼吸道病毒感染的ARI住院患儿鼻咽洗液标本中有3份检出HMPV,检出率3%。首都儿科研究所、上海市儿童医院的ARI住院患儿HMPV检出率较高,推测与标本采集时间集中于HMPV流行期及提前排除常见呼吸道病毒感染有关。

国内北京、上海、深圳、湖南的研究数据显示A、B基因型HMPV在当地同时流行,湖南研究数据显示当地流行的 HMPV有 A1、A2、B1、B2基因亚型［11-14］。本研究显示儿童居住地区存在B1基因亚型HMPV,未检出其他基因亚型HMPV,有待进一步扩大研究。在HMPV流行高峰期内RSV、流感病毒等其它病原体引起的呼吸道感染也处于高发期,HMPV引起的儿童ARI症状多样,和RSV、流感病毒等其它病原体引起的呼吸道感染的鉴别诊断比较困难［15］。因此,儿童ARI诊断中应注意 HMPV感染因素。HMPV感染尚缺乏有效的治疗和预防方法,开展HMPV感染治疗的研究,发展HMPV疫苗都已经成为当前HMPV研究的重点。

利益冲突:无