鼻病毒A21型人群血清中和抗体分布特点

朱俊琳 杨冬红 肖艳 王营 陈岚 高占成 任丽丽 王健伟

人鼻病毒(uuman rhinovirus,HRV)是常见的呼吸道病毒,为小RNA病毒科肠道病毒属成员,分为A、B和 C3个种,是无包膜的单股负链 RNA病毒［1］,目前已发现有168个型别(http://www.picor naviridae.com/enterovirus/enterovirus.htm)。HRV基因组长度约为7.2 Kb,5′端有保护性蛋白Vpg,3′端具有poly(A)尾。5′和3′两端具有非编码区。基因组编码多聚蛋白前体,经酶切后产生病毒结构蛋白(viral protein,VP)1 ～4、非结构蛋白2 A、2B、2C、3 A、3B、3C和3D。 其中VP1、VP2和VP3位于病毒表面,参与构成病毒抗原表位,可诱导宿主抗病毒中和抗体的产生［1］。

近年的研究发现,HRV不仅是急性呼吸道感染最常见的病原之一［2］,也是导致哮喘和慢性阻塞性肺疾病加重的重要病原［3］,HRV感染也可导致重症的肺部感染［4-5］,上述发现提示HRV在重症感染中的重要病原学意义。近年小RNA病毒科肠道病毒属的肠道病毒68型在全球再次流行并引起儿童迟缓性麻痹等重症感染的现象［6］,提示需要从更精确的基因型角度阐释不同型别病毒在人群中的流行特征。对人群病毒中和抗体流行特点的分析,将为评估病毒的传播流行趋势提供基础数据参考。课题组在前期研究中发现HRVA21可导致成人重症肺炎和死亡,其抗原基因VP1抗原位点发生变异［7］,为了进一步了解人群对病毒的易感性,我们从临床样本中分离了HRVA21,分析其在人群中和抗体的分布及特征,以完善和丰富对HRV病原学的认识。

1 材料与方法

1.1 样本和细胞来源 HRVA21阳性的支气管肺泡灌洗液样本采集自2013年北京大学人民医院急性呼吸道感染病例。血清采集自2013年的健康体检人群。样本采集具备知情同意。人宫颈癌细胞H1-HeLa细胞购自美国ATCC(CRL-1958)。

1.2 病毒分离 H1-HeLa细胞在37℃、5%CO2条件下,用DMEM培养基和10%胎牛血清(美国Gibco产品)在T25培养瓶中培养至单层,丰度为70%时接种样本。取200 μl支气管肺泡灌洗液样本与等体积DMEM培养基混合后接种细胞,在33℃、5% CO2条件下孵育 2 h后更换为维持液(DMEM培养基和2%胎牛血清),继续在33℃培养至细胞出现病变后。分离的病毒用低熔点琼脂糖(美国Gibco产品)进行空斑纯化。纯化后的病毒进行病毒滴度测定和序列鉴定。病毒滴度用Reed-

1.3 病毒基因序列鉴定 取200 μl病毒分离液置于2 ml裂解液中,用easyMAG全自动核酸提取仪(法国生物梅里埃产品)提取总核酸。基于既往报道的HRVA21基因组扩增特异性引物和反应条件,用SuperScriptTM一步法扩增试剂盒(美国Invitrogen公司)扩增病毒基因组［7］,5′和 3′端序列用 race 方法获得。用Mega软件(版本6.0)进行序列拼接、构建进化树和分析序列相似度。

1.4 血清中和抗体测定 血清中和抗体的测定参考世界卫生组织制订的脊髓灰质炎中和抗体测定方法［9］。H1-HeLa细胞传代至96孔板上备用。不同年龄组人群血清在56℃灭活30 min,然后稀释至1∶8到 1∶2 048,用100个组织半数感染量(tissue culture infective dose,TCID50)的HRVA21病毒25 μl与等量人血清混合均匀后,置于33℃孵育1 h,然后将混合液接种到细胞上,每个稀释度接种4个孔,在33℃孵育1 h后,用无菌PBS清洗细胞,更换维持液后继续在33℃培养,观察至出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。每批试验均设置细胞对照和病毒对照。TCID50用Reed-Muench方法计算中和抗体滴度［8］。中和抗体滴度为1∶8以上为阳性。

1.5 统计学方法 不同年龄组中和抗体阳性率的比较用卡方检验(χ2),中和抗体滴度用几何均数表示,其差异采用t检验进行分析。p＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒的分离和鉴定 将HRVA21阳性临床样本接种H1-HeLa细胞后,在33℃培养出现 CPE。如图1所示,细胞变圆脱落。纯化后的病毒全基因组序列分析显示其与来源的临床样本相似度为100%,在进化树上本研究分离毒株的序列与已有报道的HRVA21毒株在同一个进化分枝上(图2)。

图1 HRVA21感染后在H1-HeLa细胞上的病变A.细胞对照；B.感染HRVA21的细胞病变Fig.1 Cytopathic effect(CPE)of HRV-A21 on H1-HeLa cell lines(×10).A.Control.B.Cells infected with HRV-A21

图2 HRVA21病毒分离株基因组进化树●:Isolated viral strain in this study▲:Sequence of the clinical sample used to isolate HRVA21Fig.2 Phylogenetic trees of isolated HRVA21 whole genome gene

2.2 各年龄组血清中和抗体阳性率 为了评估人群抗HRVA21病毒免疫特征,本研究分析了不同年龄组人群血清中和抗体水平。如图3所示,在379份血清中,各年龄以0～5岁、5～14岁、15～25岁、26～45岁、46～60岁和60岁以上分为6组,其HRVA21中和抗体阳性率分别为21.7%、14.1%、28.2%、25.4%、27.9%和20.7%。15～25岁年龄组阳性率较高。通过卡方检验,仅5～14岁和15～25岁年龄组之间的HRVA21中和抗体阳性率具有统计学差异(χ2＝4·68454,P＝0·03044)。 将抗体滴度分为5个组:阴性(＜8)、低滴度(8～64)、中等滴度(65～128)、较高滴度(129～512)和高滴度(＞512)。如图3所示,血清样本中HRVA21的中和抗体滴度多较低,较高滴度抗体仅在婴幼儿和学龄前儿童(0～5岁)及年轻人(15～25岁)。

图3 各年龄组人群血清HRVA21中和抗体阳性率Fig.3 The positive rate of HRVA21 neutralizing antibodies(NAbs)in serum samples from healthy individuals of different age groups

2.3 各年龄组血清中和抗体滴度 为了评估人群抗体滴度的分布情况,我们比较了各年龄组个体的中和抗体几何均数(geometric mean titers,GMTs)差异。如图4所示,15～25岁年龄组GMTs较高,统计分析表明其高于5～14岁组(P＝0.0313)。其他各组间的GMTs差异无统计学意义。

3 讨论

图4 各年龄组人群血清HRVA21中和抗体滴度的几何均数Fig.4 The geometric mean titers(GMTs)of neutralizing antibodies(NAbs)in the serum samples from healthy individuals of different age groups

在常见的呼吸道病毒中,HRV在成人和儿童中的检出分别仅次于流感病毒和呼吸道合胞病毒,排在第二位［2,10-11］。但由于既往观点认为HRV感染常为自限性,并在无症状人群中也可高检出［1,12］,使得HRV在重症感染中的病原学作用一直未引起重视。近年,随着分子检测技术在临床的应用,尤其是深度测序等前沿技术的发展,发现HRV在重症呼吸道感染中扮演了重要角色［5,7,13］。但要深入阐明HRV在重症感染中的病原学意义,检测核酸不足以判断是否存在真正的病毒感染,血清学方法等经典技术有助于更充分了解病毒的感染状态。由于HRV的型别多,病毒基因分型也存在一定的技术难度,HRV通过基因重组和突变不断发生变异产生新的基因型或抗原变异株［14］,限制了从基因型角度分析HRV感染特征［15］,是否特定的基因型与重症感染有关等还不清楚。HRV各基因型间无抗原交叉反应,因此,通过型特异性中和抗体水平分析有助于更精细阐释HRV的流行特征和人群易感性。

HRVA21是一种罕见报道的基因型,在前期研究中发现其在人群中流行且可导致重症肺炎和死亡［7］。为了评估这一可致重症感染的病毒潜在的人群传播能力,本研究通过传统的病毒分离技术获得分离毒株,基于中和抗体分析来评估其人群流行特点。研究结果表明,各年龄组人群中和抗体阳性率较低,以低滴度抗体为主,提示HRVA21人群中低水平流行。5～14岁组不论中和抗体阳性率还是抗体滴度均最低,统计分析显示5～14岁组与15～25岁组间存在差异,与其他组间无显著统计差异,提示HRVA21全人群易感,学龄儿童到青少年为重点人群。本研究选择的待分析血清与病毒分离株来源的临床样本收集自同1年度,对后续年度血清和临床样本的分析有助于了解HRVA21人群中持续流行情况。

综上,本研究分析了HRVA21人群血清中和抗体水平,为评估该病毒人群流行传播趋势和丰富HRV病原学的认识提供了数据参考。分离获得的病毒毒株也将为后续研究提供了可用的资源。

利益冲突:无