云南省双柏县一犬伤多人事件调查及狂犬病病毒进化分析

郭兴祥 杨卫红 冯云 章域震 周芬 李映金 张海林

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的急性致死性中枢神经系统疾病,人主要通过患狂犬病动物咬伤而感染发病,病死率几乎为100%［1］。我国本轮狂犬病流行始于本世纪初,近10多年来,狂犬病发病数呈逐年下降趋势,从2007年3 303例下降至2017年512例［2］。云南省狂犬病流行趋势与全国狂犬病流行相似,近几年疫情亦呈明显下降趋势。楚雄彝族自治州(楚雄州)位于云南省中部地区,辖10个县(市),近几年犬间狂犬病疫情较为严重,一犬伤多人事件常有发生,几乎每年都有人间狂犬病临床诊断病例报告［3-4］。本研究于2011—2017年在楚雄州双柏县开展一犬伤多人事件监测及流行病学调查,同时采集肇事犬和狂犬病死亡患者脑组织标本进行RV抗原检测及核蛋白(Nucleoprotein,N)基因序列测定与分析,结果如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料 狂犬病病例资料来源于双柏县和楚雄州网络审核报告病例及其个案调查表。一犬伤多人事件流行病学调查资料来源于双柏县疾病预防控制中心(CDC)。

1.2 标本采集 2011—2017年双柏县CDC采集一犬伤多人事件狂犬脑组织标本7份,狂犬病病例尸检脑组织标本1份(此为一犬伤3人事件而导致死亡的狂犬病患者,经家属同意,由双柏县公安局和双柏县疾病预防控制中心专业技术人员负责采集,采集时间为患者死亡后11 h)。标本置于2 ml螺旋盖冻存管,用冷藏箱运输到云南省地方病防治所病毒实验室检测,-80℃冰箱保存。

1.3 RV抗原检测 采用直接免疫荧光试验,用荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体(Chemicon,Temecula,CA,USA)对犬和人脑组织标本进行RV抗原检测,按文献方法操作［1,7］,荧光显微镜观察结果。

1.4 RV核酸检测和N基因序列测定 采用RTPCR法。用 TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂提取病毒 RNA。用 Ready-To-Go You-Prime First-strand Beads(GE Healthcare,USA)反转录合成cDNA。巢式PCR法扩增RV N基因片段,引物及操作方法见文献［1,7］。选择RV核酸阳性样本,使用 50 μl反应体系,用 Go Taq Green Master Mix(Promega,USA)扩增N基因全序列。引物及操作方法见文献［7,9］。扩增产物在生工生物工程上海有限公司完成测序。

1.5 序列分析 用DNAStar软件的SeqMan对所获核苷酸序列进行编辑,MegAlign进行序列同源性分析；用 MEGA 5.0软件邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统进化树。除使用本次从双柏县获得的RV N基因序列外,引用GenBank中27株RV N基因序列,其中近期相邻县9株(楚雄州楚雄市1株和禄丰县2株、大理州祥云县1株、普洱市景东县2株及景谷县和镇源县各1株、红河州金平县1株)；2006—2007年楚雄州(牟定县)、曲靖和昭通市各1株；其他省份8株(四川2株、广西2株、贵州1株、湖南1株、湖北1株和重庆1株)；东南亚国家7株(缅甸1株、老挝1株、泰国1株、越南1株、柬埔寨1株、印度尼西亚1株和印度1株)。

2 结果

2.1 楚雄州狂犬病流行概况 楚雄州辖10县市,1964—2016年全州共报告狂犬病病例23例,其中1981年6例、2006年5例、2011年2例、2012年2例、2014年5例、2015年1例、2016年2例。其中楚雄市5例、牟定县6例、大姚县3例、永仁县4例、禄丰县2例、双柏县3例(1981年2例和2014年1例)。

2.2 一犬伤多人事件调查 2011—2017年双柏县共发生12起一犬伤多人事件,犬伤暴露35人,其中妥甸镇4起、法脿镇5起和大麦地镇3起(表1)。除2011年和2017年外,该县每年均有一犬伤多人事件发生,不仅县城(妥甸镇)发生犬间狂犬病疫情,边远山区(法脿镇和大麦地镇)也有犬间疫情。其中11起一犬伤多人事件(S1—S11)的32例犬伤暴露人员(均为Ⅲ级暴露)均进行伤口处理和狂犬病疫苗全程接种,至今未发病；另一起为2014年5月法脿镇发生的一犬伤3人事件(S12),3例犬伤人员均未规范处置,导致1人狂犬病发病死亡(暴露者1,矣某兰,女,45岁)、2人(暴露者2,矣某琴,女,50岁和暴露者3,黎某某,女,39岁)至今未发病。本次肇事犬为死亡患者家的自养犬(2011年12月收养犬,已养2年6个月),该犬未接种过狂犬病疫苗,咬伤第三人后被扑杀。该一犬伤3人事件发生时未上报疾控机构,暴露者1狂犬病死亡后,暴露者2/3全程接种狂犬病疫苗,双柏县CDC开展了回顾性调查。

表1 2012—2016年云南省双柏县一犬伤多人事件背景信息Tab.1 Background information of the dog-biting events from Shuangbai county of Yunnan province in 2012—2016

2.3 RV抗原检测和序列测定 送检的7份一犬伤多人肇事犬脑组织和1份人脑组织(为前述暴露者1矣某兰的标本)均为RV抗原和核酸阳性。其中,从2012—2015年的5份犬脑标本(CYN1497D、CYN1271D、CYN14127D、CYN14130D、CYN15132D)和1份人脑标本(CYN14107H)中获得N基因全序列(GenBank接受号为 KP202430、KP202440、KP072018、KT932681、KT932684 和 KT932686)。2015年和2016年各有1份犬脑阳性标本未做N基因序列测定。

图1 云南省双柏县6株狂犬病病毒核蛋白基因序列系统进化树Note:▲The rabies virus strains in Shuangbai county from 2012 to 2015Fig.1 Phylogenetic analysis on the nucleoprotein gene sequences of 6 rabies virus strains in Shuangbai county of Yunnan province

2.4 进化分析 本次双柏县6株RV的N基因序列与27株RV参考株相应序列构建系统进化树,图1显示,双柏县RV与此前鉴定的China-I(又称YNA)进化群病毒株［6-7］同在一个大分支,均属China-I进化群。但双柏株间也存在一定差异,并可分为两个进化亚支,其中来自暴露者1(矣某兰)即狂犬病病人的病毒株(CYN14107H)与同期犬病毒株(CYN1497D)亲缘关系最近,并与相邻楚雄州禄丰县(CYN1499D)和普洱市景东县(CYN1373D)流行株具有较近的进化关系；另4株则与相邻大理州祥云县(CYN13115H)、楚雄市(CYN1381D)和四川省(SCR1016P)流行株进化关系最近。进化分析还发现,双柏株与2006年和2007年云南省昭通市(Yunnan Zt07)、曲靖市(Yunnan Qj07)和楚雄州牟定县(Yunnan Md06)流行株进化关系较远,并与我国广西(GXSL和GXN119)、贵州(Guizhou A101)、重庆(CQ92)等省区以及缅甸(9909BIR)、老挝(02001LAO)、泰国(D9/52)、越南(01016VNM)和柬埔寨(9908CBG)等东南亚流行株存在明显差异(图1)。

2.5 同源性分析 本次双柏县6株与省内相邻地区(12株)和四川省(2株)RV流行株N基因序列进行同源性分析,表2显示,双柏县6株RV的核苷酸和氨基酸同源性均在99.6% ～100%之间,它们与相邻楚雄州楚雄市(CYN1381D)和禄丰县(CYN1267D)、大理州祥云县(CYN13115H)和四川省(SCR1016P和SCR0967)流行株的核苷酸和氨基酸同源性亦为99.6% ～100%,但与2006年云南省楚雄州牟定县(Yunnan Md06)、2007年昭通市(Yunnan Zt07)和曲靖市(Yunnan Qj07)流行株核苷酸和氨基酸同源性分别为97.1%～99.3%和99.1% ～99.6%。

3 讨论

由于犬类仍然是当前我国人类狂犬病的主要传染源,控制犬间狂犬病疫情对消除人间狂犬病具有十分重要的意义［5］。楚雄州疾病预防控制中心于2011年开始在楚雄州建立一犬伤多人事件监测系统,对及时发现犬间疫情和防控人狂犬病起到重要作用［6］。本次双柏县调查结果表明,2011—2017年该县共发生12起一犬伤多人事件,但仅发生1例人狂犬病,一犬伤多人事件监测在预防人狂犬病中发挥了极为重要的作用。前述该县一犬伤3人事件由于漏报而导致1例人狂犬病发病死亡,此与犬伤暴露者对狂犬病危害性认识不足,暴露后未到医疗卫生机构就诊有关。因此,加强偏远地区一犬伤多人事件及其他犬伤事件的监测,进一步开展狂犬病防治知识宣传教育,全面提高人民群众的自我防护意识仍然是当前面临的重要任务。

暴露后预防处置对预防人狂犬病至关重要［7］。本次双柏县漏报的一犬伤3人事件的3名暴露人员均未接受规范的暴露后预防处置,导致暴露者1(矣某兰)发病死亡。结合临床表现并从该患者脑组织中检测到RV,根据中华人民共和国卫生行业标准《WS 281-2008-狂犬病诊断标准》,该病例为狂犬病实验室诊断病例,亦为云南省本轮狂犬病流行中(2000年以来)双柏县唯一1例人狂犬病。暴露者1狂犬病发病死亡后,通过对暴露者2(矣某琴)和暴露者3(黎某某)的全程补种狂犬病疫苗,对预防发病无疑是有效的。

表2 云南省双柏县6株狂犬病病毒核蛋白基因核苷酸和氨基酸同源性比较Tab.2 Homology analysis of nucleotide and amino acid of nucleoprotein gene fragment of 6 RV strains in Shuangbai county of Yunnan province

目前,中国RV可分为6个进化群(China-I、Ⅱ、Ⅲ、IV、V和 VI),其中 China-I是近几年优势流行株,主要流行于中国南方,近几年也有向北方扩散的趋势［8-9］。 以往证实,云南省有 YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4个进化群流行,并依次属于China-I、China-VI、China-Ⅱ和 China-Ⅲ［4］。 然而,近几年云南流行的RV种群发生了明显变化,China-I成为主要进化群,未再发现其他进化群的流行［4,10］。楚雄州位于滇中地区并与四川省相邻,此前该州仅发现China-I(YN-A)［3］。本次进化分析和同源性分析表明,无论是来自双柏县患者或犬类还是楚雄州其它地区(楚雄市和禄丰县)犬类的RV间均具较近亲缘关系,同时还表明该州RV种群分布较为单一,均为China-I,并与相邻州、市、县及四川省的China-I流行株高度同源,提示该地区狂犬病传播来源很可能是四川省。序列分析还发现,近几年双柏县及其相邻地区RV流行株与2006—2007年楚雄州、昭通市和曲靖市RV China-I流行株存在明显差异,且2006—2007年云南流行株与2005年湖南和湖北省流行株亲缘性较高,提示云南本轮狂犬病流行前期和近期的RV China-I流行株的传播来源不同,但它们都来自与云南相邻的省份,且前期流行株已被当前流行株替换为主要或唯一流行株。

利益冲突:无