不同红曲菌中红曲色素与橘霉素的比较分析

刘 姣，周有祥，徐 琪，李 利，杨 洁，彭立军,*

（1.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北 武汉 430064；2.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434023）

红曲菌（Monascus spp.）是我国传统的药食两用丝状真菌，自1884年Van Tieghem建立红曲菌属以来，已报道有12 种[1-2]。红曲是红曲菌发酵大米等淀粉类原料获得的产品，在我国及东南亚有近两千年的应用历史[3-5]。目前，我国商品化红曲主要包括色曲、酯化红曲以及功能性红曲3 种，广泛应用于食品加工、酿造、医药和保健品等领域[6-9]。

现代研究表明，红曲菌可产生多种有益的次级代谢产物，主要包括红曲色素（Monascus pigments，Mps）、莫纳可林（Monacolin K，MK）、麦角固醇、γ-氨基丁酸（γ-anminobutyric acid，GABA）、不饱和脂肪酸等[10-12]。其中，Mps是我国允许使用的食品添加剂中唯一一个微生物来源的天然色素。不仅可用作食品着色剂，还具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化的功效，在我国应用广泛并远销海外[8-9,13]。与安全性频频受到质疑的合成色素相比，天然安全的Mps产品需求日益旺盛[14-15]。

然而，1995年Blanc等[16]鉴定出紫色红曲菌（Monascus purpureus）中的抑菌因子Monascidin A为橘霉素（citrinin，CIT）后，红曲及其相关产品的安全性备受质疑[17-19]。CIT为肾毒性真菌毒素，可引起肾肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，对胚胎发育也有一定影响具有致畸性[20-22]。目前，欧盟和日本等地区和国家限定红曲产品中CIT的含量应低于0.02 mg/kg[23]。GB 1886.181—2016《食品添加剂 红曲红》和QB/T 2847—2007《功能性红曲米（粉）》规定红曲红产品中CIT的限量标准为0.04 mg/kg，功能性红曲米中CIT的限量标准为0.05 mg/kg[24-25]。筛选低产或不产CIT菌株成为近二十多年红曲研究的热点[26-29]。

本研究通过超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法分析比较22 株红曲菌发酵红曲米中的Mps和CIT的含量差异，并利用主成分分析分析不同菌株及其产物差异的相关性。结果可为红曲产品中CIT含量的控制，挑选高产Mps、低产或不产CIT的红曲菌株提供数据参考，并为系统分析不同红曲菌株代谢产物轮廓提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

供试菌株信息见表1。21 株从中科院微生物研究所购得，M7为华中农业大学实验室分离得到，其中14 株为模式菌株。

表1 实验红曲菌菌株信息Table 1 Information about Monascus strains used in this study

1.1.2 培养基与试剂

马铃薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂按1.5%～2%添加，用于PDA斜面的制备；米饭培养基：市售粳米浸泡2 h后晾干，称取30 g装于250 mL三角瓶中，用于红曲菌的培养。以上培养基均于（121±1）℃灭菌20 min。

甲苯、乙酸乙酯、甲酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯） 德国Merck公司；CIT标准品（C13H14O5，CAS号518-75-2，纯度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

配制复合萃取剂：按甲苯-乙酸乙酯-甲酸体积比7∶3∶1配制，用于Mps和CIT的提取[30]。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC仪 美国Waters公司；AIRTECH SW-CJ-2FD洁净工作台 中国苏州安泰空气技术有限公司；MLS-3750型全自动高压蒸汽灭菌锅 日本松下电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CIT标准曲线的制备

以5、10、50、100、500 ng/mL梯度质量浓度的CIT标准工作溶液进样分析，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，制备标准曲线。

1.3.2 红曲米制备

菌株活化与培养：将22 株红曲菌株分别接种至PDA斜面，其中CGMCC 3.5845、CGMCC 3.5836和CGMCC 3.5843置于24 ℃，其他菌种均置于28 ℃培养15 d。孢子制备和接种：用无菌水洗涤孢子，经两层无菌擦镜纸过滤后得孢子悬液，接种3 mL孢子液（105个/mL）至灭菌大米培养基中，混匀，培养条件同上，每菌株3 个平行，未接种米饭培养基作为空白对照。

1.3.3 样品前处理

参照GB/T 5009.222—2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》中固态红曲类样品的处理方法，略有改进，步骤：将红曲米样品于60 ℃左右烘干至质量恒定后粉碎，称取0.100 0 g左右样品于2 mL离心管中，加入1 mL萃取剂，涡旋振荡30 s后，超声10 min，10 000 r/min离心2 min，收集上清液，残渣重复萃取1 次，合并上清液后，氮气吹干，以甲醇定容至1.0 mL，过0.22 μm有机滤膜，待分析。

1.3.4 Mps及CIT含量及数据分析

Mps分析：固定相为BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），配备二极管阵列检测器，分别于380、470 nm和520 nm波长下检测红曲黄色素、橙色素和红色素，流动相条件参见文献[31]。CIT分析：固定相为BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），配备检测器为荧光检测器，激发波长为330 nm，发射波长为500 nm，流动相条件参见文献[23]。CIT标样质量浓度为500 ng/mL，进样量为5 μL，以外标法定量。取质量浓度为0～40 ng/mL系列梯度标准溶液，按照GB/T 27415—2013《分析方法检出限和定量限的评估》测定仪器检出限，方法检出限按照0.1 g红曲米定容至1 mL换算。

将22 株红曲菌及对应的Mps和CIT含量按类别归一化后，导入SIMCA 13.0进行主成分分析，结果用得分图和载荷图表示。

2 结果与分析

2.1 红曲米形态分析

图1 红曲米形态比较分析Fig. 1 Comparison of morphology of Monascus fermented rice

由图1可知，红曲米外观完整，稍有酸气、味淡，其中13 个红曲米呈紫红色（1 株烟灰色红曲菌、1 株火红色红曲菌、1 株橙色红曲菌、7 株紫色红曲菌、2 株红色红曲菌、1 株血色红曲菌），9 个呈棕色（1 株发白红曲菌、1 株紫色红曲菌、1 株巴克红曲菌、2 株从毛红曲菌、1 株红色红曲菌、1 株佛罗里达红曲菌、1 株苍白红曲菌、1 株新月红曲菌），这可能与不同菌株所产的次级代谢产物的种类和含量不同有关。

2.2 CIT标准曲线的制备和检出限

将CIT标准溶液配制为5～500 ng/mL系列梯度质量浓度标准溶液，进样量为5 μL，按1.3.4节中方法测定CIT含量，以CIT质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析，结果表明在0～500 ng/mL范围内，其CIT的线性回归方程为y=4 165.7x-14 087，相关系数R2为0.999 7，线性良好。按照GB/T 5009.222—2008，计算得到CIT的仪器检出限为0.178 ng/mL，方法检出限为1.78 μg/kg（按0.1 g红曲米定容至1 mL计算），满足国标分析要求[32]。

2.3 22 株红曲菌Mps含量分析

将1.3.3节中处理的样品于超UPLC-二极管阵列检测器条件下分析，22 株红曲菌中有13 株（M7、3.4629、3.2636、3.4443、3.5845、3.2093、3.5836、3.4634、3.4651、3.5838、3.4384、3.4453、3.4639）可产生2 种主要的黄色素Monascine（YP1）和Ankaflavin（YP2）、2 种主要的橙色素Rubropunctatin（OP1）和Monascuburin（OP2）、2种主要的红色素Rubropunctamine（RP1）和Monascuburamine（RP2），色素结构信息见参考文献[33]，结果如图2所示。

图2 22 份红曲米样品中Mps含量分析Fig. 2 Mps contents of 22 red fermented rice samples

由图2可知，M7、3.2636、3.4443、3.4651和3.5838可产生红曲黄、橙、红3种色素且含量均较高，其中黄、橙、红色素含量最高的菌株分别为3.2636、3.4443和3.5838；3.2093、3.4384、3.4629、3.5836和3.5845中红曲黄、橙色素含量较高且与前述M7等5 株菌所产黄、橙色素含量接近，而红曲红色素含量约为3.5838所产红色素的1/10；3.4634可产生含量较高的红曲黄、红色素，而红曲橙色素含量较低，含量仅为3.4443的1/100；3.4453和3.4639所产3 种色素含量均明显低于其他11 个菌株的色素含量。此外，有9 株红曲菌（3.4701、3.5844、3.7951、3.5843、3.4452、3.568、3.4646、3.4647和3.444）未检出Mps。

2.4 22 株红曲菌CIT含量分析

图3 CIT标准品（a）及红曲米中CIT（b）的液相色谱图Fig. 3 Liquid chromatograms of citrinin standard (a) and citrinin in fermented rice (b)

质量浓度为500 ng/mL CIT标准品溶液（图3a）及红曲米中CIT（图3b）在1.3.4节所使用的色谱条件下出峰时间为8.927 min。由图3可知，本研究中建立的UPLC方法分析红曲米中CIT分离度较高，无杂质干扰，可用于红曲米中CIT的检测。

图4 22 份红曲米样品中CIT含量检测Fig. 4 CIT contents in 22 fermented rice samples

22 份红曲米中CIT含量最高的是橙色红曲菌3.4384，含量为（1 263±40.48）mg/kg，已检出的CIT含量最低的为苍白红曲菌3.5844，含量为（0.08±0.01）mg/kg。由图4可知，17 份红曲米样品中CIT含量均超过我国功能性红曲米中CIT限量标准（0.05 mg/kg），CIT含量在0.084～1 263.365 mg/kg之间，有5 份红曲米（3.4701、3.4452、3.568、3.4646和3.444）中未检出CIT。

2.5 22 株红曲菌Mps和CIT的比较分析

通过UPLC分析22 份红曲米中Mps和CIT的含量，结果表明22 株红曲菌产物差异明显。17 株红曲菌中有4 株菌（3.4647、3.5843、3.7951和3.6844）仅产生CIT而不产Mps； 3.4443、3.4651、3.5838、3.2093、3.4629和M7发酵红曲米中CIT含量较低，主要产物是红曲橙色素和黄色素，其中橙色素的含量约为黄色素的2 倍；3.5845、3.2636、3.5836、3.4636及3.4384的主要产物均为CIT。随后对这22 株红曲菌样本进行了主成分分析，结果如图5所示。

图5 22 株红曲菌及其产物主成分分析得分图（a）和载荷图（b）Fig. 5 PCA score plot (a) and loading plot (b) for pigment metabolites of 22 Monascus strains

图5 显示了不同菌株的代谢轮廓相似性信息和各产物的贡献率。由图5a可知，成分1累计贡献率为62.9%，成分2累计贡献率为18.9%，2 个成分的累计贡献率达到81.8%，因此在95%置信区间内，该2 个主成分的可信度较高。在得分图中，22 株红曲菌分为了4 组，其中左侧11 个菌株（3.4639、3.4701、3.4453、3.444、3.4647、3.4646、3.5843、3.7951、3.5844、3.4452和3.568）聚集在一起，主要是由于这些菌株不产色素或CIT，或者产量较低；右侧有10 个菌株分成了两组，包括右上的5 个菌株（3.5836、3.4629、3.5845、3.2093和3.2636）和右下的5 个菌株（3.4634、3.4651、M7、3.4443和3.5838），其中右上的5 个菌株主要产黄、橙色素和CIT，右下的5 个菌株主要产红色素和少量CIT；需要指出的是橙色红曲菌3.4384因CIT含量过高而相对离散自成一组。该分析结果表明，在产Mps和CIT的红曲菌株中，黄、橙色素与CIT呈正相关，而红色素与CIT呈负相关。

3 结 论

红曲菌可产生多种次级代谢产物，其中Mps作为一种天然、安全的微生物来源色素备受关注，安全、低产甚至不产CIT的Mps产品的开发是目前Mps产业发展的重要研究方向。

本实验以22 株红曲菌发酵红曲米为研究材料，分析不同红曲菌的产物特征。形态结果表明13 个红曲米呈紫红色，9 个呈棕色。进一步分析22 份红曲米样品的Mps和CIT含量，结果表明，有13 株红曲菌可产生Mps和CIT，4 株红曲菌仅产生CIT不产生Mps，5 株红曲菌均不产Mps和CIT，这与红曲米表观形态结果相符。其中3.4443、3.4651、3.5838、3.2093、3.4629和M7发酵红曲米中Mps含量较高且CIT含量较低，可用作高产Mps低产CIT的选育菌种。3.2093、3.4629的主要产物是橙色素，其含量约为黄、红色素含量的2 倍和50 倍，且CIT含量仅为3.4384中CIT含量的1/1 000，可用作单一红曲橙色素产品的开发。此外，有5 株菌（3.4701、3.4452、3.568、3.4646和3.444）既不产Mps也不产CIT，其代谢产物还有待进一步解析。利用主成分分析方法分析了红曲菌的代谢产物差异和菌株之间的联系，但还需更多的产物数据和方法探索，具体还有待进一步开展研究。本研究分析了实验室条件下不同红曲菌发酵红曲米的产物差异，可为构建不同红曲菌代谢产物轮廓提供基础数据，并可为实际生产中依据菌株产物差异进行针对性的工艺条件优化提供参考。