基于间酪氨酸和邻酪氨酸鉴定辐照海产品

邵宏宏，相兴伟*，郑 斌，周秀锦，周宇芳，周向阳，傅谧妮

（1.舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316000）

海产品的新鲜度是其品质的重要指标，辐照作为一种新兴的加工技术，因其高效的杀菌作用，在全球食品加工领域得到了广泛应用[1]，近年来，在海产品加工、运输及储存过程中利用辐照技术进行杀菌保鲜，以达到最大限度延长货架期的目的[2-3]。目前，由于辐照对食品的品质和安全性的影响还尚未定论[4-5]，欧盟、美国等发达国家均要求进口辐照食品应有国际食品辐照标识（1999/2/EC）。我国出口欧盟及日本的海产品多次发生由于无辐照标识而被退货的事件，给企业造成巨大经济损失。

目前，关于辐照食品检测方法研究的报道很多，但是受方法本身采用的原理所限，每种方法均适用于特定类型的样品[6-14]，由于海产品脂肪含量少，且常采用多次漂洗、蒸煮、烘烤等加工方式，采用现行的方法在检测辐照海产品存在一定难度，如采用热释光法需在样品中提取一定量的硅酸盐，而鱼肉、鱿鱼丝等产品由于受加工工艺影响，无法提取到足够量的硅酸盐用于检测[15-16]。食品中苯丙氨酸经辐照后，在氧化压力条件下，与辐照产生的羟自由基反应，产生酪氨酸3 种异构体——对酪氨酸、邻酪氨酸和间酪氨酸[17]。由于机体本身并不存在间位酪氨酸和邻位酪氨酸，因此，可通过对其含量进行测定作为含蛋白质食品是否经过辐照的判断依据。但食品经辐照后只产生微量的酪氨酸同分异构体且较难分离，相对而言，在辐照生成的酪氨酸异构体中，邻酪氨酸的量最大[18]。因此在目前关于酪氨酸同分异构体检测的报道中，主要选用邻酪氨酸作为检测含蛋白质辐照食品的探针化合物，利用高效液相色谱法应用柱前衍生化或直接经反相高效液相色谱分离检测，但存在衍生化产物不稳定、试剂昂贵，重现性差等问题[19-21]。Chen Si等[22]利用辐照后氨基酸特异性产物对辐照肉类的检测进行了相关研究。刘茜等[23]建立了高效液相色谱-串联质谱技术检测辐照蛋白质类功能食品中邻酪氨酸和间酪氨酸的方法。但目前对海产品辐照研究的报道较少，此外关于邻酪氨酸和间酪氨酸作为海产品辐照产物的特异性和稳定性研究鲜见报道。

本研究采用高效、高灵敏度的超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole linear ion trap tadem mass spectrometry，QTRAP-UPLC-MS/MS）技术，以及精确的多反应监测-信息关联采集-增强子离子（multiple reaction monitoring information-dependent acquisitionenhanced product ion，MRM-IDA-EPI）监控模式，对不同海产品中的酪氨酸同分异构体进行有效分离和二次定性，准确测定海产品中辐照标识物含量。在此基础上，对不同加工方式处理后的各类海产品及其加工制品中邻酪氨酸和间酪氨酸进行检测，对邻酪氨酸和间酪氨酸作为辐照标识物的特异性进行研究；不同加工方式和前处理方式对辐照衍生物稳定性的影响；测定不同剂量辐照后多种海产品中辐照标识物的含量，确定海产品的种类和氨基酸含量对辐照检测的影响，为辐照海产品的鉴定检测提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丙酮、甲醇（均为色谱纯） 德国默克公司；去离子水（电阻率18.2 MΩ•cm），经0.22 µm微孔滤膜过滤后使用；甲酸 德国Riedel deHaen公司；氨基酸标准品：DL-酪氨酸 （CAS：556-03-6，纯度≥99.0%）、间酪氨酸（CAS：775-06-4，纯度≥99.0%）、邻酪氨酸（CAS：2370-61-8，纯度≥98.0%）、丙苯氨酸（CAS：150-30-1，纯度≥99.0%） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

UPLC-20ADXR系列液相色谱（配有溶剂脱气装置、自动进样器） 日本Shimadzu公司；QTRAP 5500三重四极杆复合离子阱质谱仪 美国AB Sciex公司；天平（感量0.000 1 g）；超声波清洗器 德国Elma公司；MSI漩涡振荡器 德国IKA公司；3-18K低温高速离心机美国Sigma公司；恒温干燥箱 美国Thermo Fish公司；自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

为保证样品的新鲜度且未经加工处理，无任何添加剂处理，选取浙江舟山及东海区域典型且出口量较大的海产品。海水鱼类选取鲐鱼（Pneumatophorus japonicus），海水甲壳类选取大管鞭虾（Solenocera melantho）又称红虾，是目前浙江舟山市出口量最大的虾类产品。水产制品选取头足类的鱿鱼，并加工成干制鱿鱼丝[24]。

各类海产品均来自于浙江舟山市各大水产加工企业，实验中采用的未辐照样品为来自于水产企业未经任何加工处理的水产样品，干制品为加工后未经辐照处理的样品；辐照样品为经γ射线（60Co为放射源）辐照处理的样品，用剂量计跟踪测定样品的吸收剂量；新鲜海捕水产品及制品取可食部分，冻制品等解冻后匀浆于-20 ℃保存备用。

1.3.2 样品前处理

准确称取0.8 g经匀浆后的样品于10 mL塑料离心管中，加入3 mL 体积分数为0.1%甲酸溶液，均质1 min，室温超声振荡提取30 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min。将上清液转移至另一离心管中，加入8 mL丙酮，于-18 ℃静置2 h，沉淀蛋白质，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL置于玻璃管中。35 ℃条件下N2吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液溶解，用0.22 µm水相尼龙滤膜过滤，上机待测。

干制海产品由于含水量低，其游离氨基酸含量少，因此需通过酸水解的方式对辐照产物进行提取。将待测的干制水产品充分混匀，用剪刀剪碎，尤其是鱿鱼丝，避免缠绕住粉粹机刀头使之过载；搅碎后装入容器内，密封、冷藏（-18 ℃）备用；准确称取0.5 g，经前处理后的样品于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L盐酸，充氮气后盖紧旋盖，于110 ℃酸解过夜。取酸解液用滤纸过滤后，置于玻璃离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。取上清液5 mL，35 ℃条件下N2吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液溶解后过滤膜待测。

1.3.3 色谱及质谱条件

1.3.3.1 色谱分离条件

采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm），流速0.4 mL/min；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸溶液；进样量：2 µL；柱温：35 ℃；流动相的梯度洗脱程序为：0～5 min，5%～30% B，5.1～8 min 30%～5% B，对色谱柱进行冲洗，结束整个检测流程。

1.3.3.2 质谱条件

离子源Turbo V，电离模式电喷雾电离，正离子模式；采集方式MRM模式，离子化温度550 ℃；喷雾电压5 500 V，雾化气压力55 psi，辅助气压力60 psi，气帘气压力30 psi，碰撞气压力为 High；入口电压10 V，碰撞室出口电压13 V。各化合物的具体采集参数见表1。

采用MRM-IDA-EPI模式监测。MRM触发增强子离子扫描IDA-EPI条件：IDA触发信号强度阈值5 000；EPI条件：扫描速率10 000 Da/s；扫描范围：50～200 Da；离子源同载气条件同MRM；DP电压80 V；碰撞能量35 V，碰撞能量谱宽为15。

表1 优化的质谱条件参数Table 1 Optimized MS/MS parameters for determination of the isomers

1.3.4 其他测定方法

水分含量测定：采用GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的直接干燥法[25]；脂肪含量测定：采用GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[26]；蛋白质含量测定：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[27]；氨基酸含量测定：采用 GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[28]。

2 结果与分析

2.1 主要成分及氨基酸含量

同一种海产品的苯丙氨酸和酪氨酸含量会随所处环境、捕获季节、所处的生长期等多种因素的影响[29]。辐照样品中的邻酪氨酸和间酪氨酸由苯丙氨酸经氧化后产生，为探明海产品中不同苯丙氨酸和酪氨酸含量对辐照产物的影响，对鲐鱼、大管鞭虾及干制鱿鱼丝中苯丙氨酸和酪氨酸及相关成分含量进行了测定，结果见表2。大管鞭虾中水分含量最高，不同的海产品中蛋白质质量分数在16.7%～26.2%之间。鲐鱼中具有较高的脂肪含量，海产品主要成分因海产品种类不同而存在差异。

表2 海产品成分分析（n=3）Table 2 Chemical composition of seafood (n= 3)

2.2 辐照剂量对标识物标准品的影响

取质量浓度为1 mg/L的苯丙氨酸、对酪氨酸、邻酪氨酸和间酪氨酸标准水溶液，分别进行0.5～50 kGy不同剂量的辐照，与未经辐照的苯丙氨酸标准水溶液均用QTRAP-UPLC-MS/MS进行测定。结果显示（图1、2）在未经辐照的苯丙氨酸标准溶液中，只检测到苯丙氨酸，而经不同剂量辐照后溶液中检测到不同浓度的对酪氨酸、邻酪氨酸及间酪氨酸（表3），产生的3 种酪氨酸同分异构体含量随接受到的辐照剂量增大而增加，呈现良好的线性关系（表4）。

图1 苯丙氨酸MRM图Fig. 1 MRM chromatogram of phenylalanine

图2 辐照后苯丙氨酸MRM图Fig. 2 MRM chromatogram of phenylalanine after irradiation

表3 苯丙氨酸辐照后酪氨酸含量（n= 3）Table 3 Contents of tyrosine isomers after irradiation of phenylalanine (n= 3)

表4 苯丙氨酸辐照产物线性方程Table 4 Linear equations for tyrosine isomers

苯丙氨酸溶液用高纯度的苯丙氨酸标准品与经过高温消毒的去离子水配制，不含其他酶及其他物质，接受辐照后产生酪氨酸同分异构体，由此可知苯丙氨酸接受辐照产生酪氨酸这一过程不需要酶及其余物质的参与。

在低剂量辐照下，在3 种辐照产物中对酪氨酸的含量最高，邻酪氨酸次之；随着辐照剂量的加大，间酪氨酸含量迅速上升，当辐照强度为5 kGy时，3 种同分异构体含量最为接近；辐照剂量上升至10 kGy时，由苯丙氨酸辐照产生对酪氨酸、间酪氨酸和邻酪氨酸的质量百分比分别为0.36%、0.47%和4.9%；为当辐照剂量高达50 kGy时，邻酪氨酸和间酪氨酸质量浓度分别达到19.971 μg/L和19.540 μg/L，超过对酪氨酸的13.892 μg/L。

同时，分别经不同剂量辐照的对酪氨酸、邻酪氨酸和间酪氨酸3 种标准溶液中无其他物质的出现，其含量无变化。对酪氨酸的标准溶液即使经高剂量的辐照也无法产生其他两种同分异构体，邻酪氨酸和间酪氨酸亦然，因此，辐照不能使这3 种酪氨酸相互转化，且不影响这3 种同分异构体的稳定性。

2.3 加工方式对辐照标识物的影响

分别采用海产品加工中常用的方法对不同海产品进行处理，检测处理后的样品中有无邻酪氨酸和间酪氨酸产生，研究其他加工方式是否会导致这两种同分异构体的产生。实验中采用了3 种加工方式：100 ℃蒸煮30～60 min；150 ℃烘烤2 h及50 ℃干燥24 h。经加工后的样品前处理后上机检测，结果显示经50 ℃干燥24 h、100 ℃蒸煮30 min和150 ℃烘烤2 h后的样品中无邻酪氨酸和间酪氨酸产生，但经100 ℃蒸煮60 min后的部分样品中有微量邻酪氨酸产生，但未检测到间酪氨酸。因此采用液相色谱只对食品中的邻酪氨酸进行测定从而判断食品是否进行辐照的方法易出现假阳性的结果。本实验采用同时检测邻酪氨酸和间酪氨酸的含量对辐照海产品进行鉴定，因此对样品进行100 ℃蒸煮60 min的处理不会影响辐照与否的鉴定，将邻酪氨酸和间酪氨酸作为辐照标识物可作为辐照海产品鉴定的依据。

2.4 海产品中标识物含量影响因素

2.4.1 海产品种类与标识物含量

苯丙氨酸经辐照后会产生对酪氨酸、邻酪氨酸和间酪氨酸，但海产品中本身存在高含量的对酪氨酸（表2），因此经辐照后产生的对酪氨酸与自身所含对酪氨酸相比可忽略不计。因此只对经0.5～50 kGy不同剂量辐照后的海产品中邻酪氨酸和间酪氨酸含量进行测定。由图3可知，辐照海产品中邻酪氨酸和间酪氨酸的浓度随着接受到的辐照强度的增大而增加，呈现正相关性，但增长的速率因样品不同而存在差异；相对而言，大管鞭虾中邻酪氨酸和间酪氨酸产生速度最快且含量最高，朱珍等[20]采用液相色谱法对辐照水产品中邻酪氨酸进行了测定，结果显示大管鞭虾中邻酪氨酸含量最高，与表3结果相似。辐照后产生的邻酪氨酸含量高于间酪氨酸，与报道一致[19]。

图3 辐照大管鞭虾（A）、鲐鱼（B）和干制鱿鱼丝（C）中间酪氨酸和邻酪氨酸含量Fig. 3 Contents of o-tyrosine and m-tyrosine in irradiated S. melantho (A),mackerel (B), and dried squid (C)

2.4.2 辐照剂量与标识物含量

辐照剂量是影响辐照标识物含量主要因素之一，低至0.5 kGy的辐照强度即可使海产品中产生一定含量的邻酪氨酸和间酪氨酸，继而判定样品是否经过辐照；辐照强度与辐照标识物含量呈正相关性，与刘茜等[23]对辐照蛋白质类功能食品的研究一致。但与图2中针对苯丙氨酸水溶液的辐照结果不同，样品接受的辐照剂量与辐照标识物无显著的线性关系，样品基质的复杂性对辐照标识性产物邻酪氨酸和间酪氨酸的含量产生了影响。

在相同剂量的辐照下，不同海产品产生的邻酪氨酸和间酪氨酸浓度不等（大管鞭虾＞鲐鱼＞干制鱿鱼丝）。对这3 类海产品的成分分析显示（表2），鲐鱼和干制鱿鱼丝中蛋白质和苯丙氨酸含量均高于红虾，但同剂量辐照下邻酪氨酸和间酪氨酸的含量却低于红虾，因此，海产品中苯丙氨酸质量浓度与其辐照产物邻酪氨酸和间酪氨酸质量浓度不呈正相关性，海产品均富含苯丙氨酸，其含量不是决定辐照标识物质量浓度的决定因素。

2.4.3 水分与标识物含量

辐照标识物的产生与海产品中水分含量密切相关。红虾中的水分质量分数高达81.6%，是本实验样品中最高（大管鞭虾＞鲐鱼＞干制鱿鱼丝），不论在0.5 kGy低强度还是在超过7 kGy高强度（0.5～50 kGy）辐照下红虾中产邻酪氨酸和间酪氨酸的浓度均为最高（大管鞭虾＞鲐鱼＞干制鱿鱼丝）。酪氨酸同分异构体通过在氧化压力下羟自由基与苯丙氨酸分子反应形成[30-31]，苯丙氨酸的氧化和酪氨酸同分异构体的产生取决于羟自由基产生的效率，羟自由基由水分子产生，因此样品中水分含量是影响辐照标识物产生的重要因素。Zhang Jingjing等[17]通过表面增强拉曼散射技术测定苯丙氨酸溶液辐照后产生对酪氨酸、邻酪氨酸和间酪氨酸3 种同分异构体，且产生的含量与溶液中的羟自由基浓度相关。因此通过对辐照标识物邻酪氨酸和间酪氨酸含量对海产品所接受辐照剂量的准确测定需根据其不同样品类别、样品状态判定，但可对样品是否经过辐照进行准确快速的鉴定，避免其他如热释光法、光释光等方法的假阴性及二次辐照的状况。

2.5 辐照标识物稳定性

2.5.1 贮藏条件的影响

采用0.5、1.0、5.0、7.0、10.0、20.0 kGy对样品进行辐照分别用PE袋单独包装并密封，保存条件分别为冷冻-20 ℃、冷藏4 ℃、常温20 ℃贮藏，贮藏不同时间后进行测定。图4显示：辐照大管鞭虾未经贮藏及在-20、4 ℃和20 ℃分别贮存90、20 d和7 d后样品中间酪氨酸和邻酪氨酸测定结果。在-20 ℃贮存条件下，储存时间长达90 d时，间酪氨酸和邻酪氨酸含量与未经贮存的样品相比略有升高，这可能与长期冷冻条件下，样品的水分流失有关，但一定程度上表明在此储存条件下间酪氨酸和邻酪氨酸较为稳定，受外界因素影响较小。在4 ℃贮存20 d后，间酪氨酸和邻酪氨酸含量基本保持稳定，只略有下降；在20 ℃贮存7 d后，样品呈现明显的腐败状态，间酪氨酸和邻酪氨酸含量下降，但是即使是经0.5 kGy低剂量辐照样品中仍能检测到一定含量的间酪氨酸和邻酪氨酸，并与辐照剂量仍然呈现正相关性。因此，不同贮藏条件不影响对样品是否经过辐照的判定。

图4 不同贮存条件下间酪氨酸（A）和邻酪氨酸（B）的含量变化Fig. 4 Changes in m-tyrosine (A) and o-tyrosine (B) contents at different storage temperatures

2.5.2 加工方式的影响

图5 不同加工方式后间酪氨酸（A）和邻酪氨酸（B）含量变化Fig. 5 Changes in m-tyrosine (A) and o-tyrosine (B) contents after different thermal processing treatments

采用海产品加工中常用的3 种加工方式对不同剂量辐照后的样品进行处理，研究不同加工方式对本研究确立的通过间酪氨酸和邻酪氨酸作为标识物检测辐照海产品方法的影响。分别采用漂烫（50 ℃水中5 min）、蒸煮（100 ℃、10 min）及烘烤（115 ℃、8 min）3 种方式对辐照后样品进行加工处理，与未经加工处理的样品进行对照，测定间酪氨酸和邻酪氨酸含量，结果见图5，辐照后不同的加工方式对样品中的间酪氨酸和邻酪氨酸含量具有一定影响，其影响作用最大为烘烤（115 ℃、8 min）的加工方式，对海产品的形态影响较为显著，其水分快速流失，蛋白质凝固，样品整体质地变硬，影响间酪氨酸和邻酪氨酸的提取，对定量检测产生影响，使检测到的间酪氨酸和邻酪氨酸含量下降。蒸煮（100 ℃、10 min）的加工方式也会导致间酪氨酸和邻酪氨酸损失，蒸煮过程一部分游离氨基酸会溶解到水中，造成游离间酪氨酸和邻酪氨酸含量减少。影响最小加工方式为漂烫（50 ℃、5 min），对辐照标识物的含量基本无影响。不同加工方式对间酪氨酸和邻酪氨酸含量的影响存在差异，与海产品经不同方式加工后其形态、水分含量、蛋白质组成等发生不同程度的变化，从而导致间酪氨酸和邻酪氨酸含量发生变化。

3 结 论

辐照可诱导苯丙氨酸产生酪氨酸的3 种同分异构体即对酪氨酸、间酪氨酸和邻酪氨酸，且无需其他酶和微生物的作用。在无基质干扰的情况下，辐照剂量与辐照标识物的含量呈线性关系。不同的加工方式对间酪氨酸和邻酪氨酸辐照特异性标识物的鉴定不产生影响。针对海产品，辐照剂量和水分与辐照标识物产生的含量密切相关。在-20 ℃条件下，间酪氨酸和邻酪氨酸具有良好的稳定性；不同贮藏条件和加工方式对辐照海产品中辐照标识物酪氨酸的间酪氨酸和邻酪氨酸含量存在一定影响，但是仍能提取到足够量的间酪氨酸和邻酪氨酸用于辐照海产品的鉴定，该方法最低可检测到经0.5 kGy辐照的样品。因此，采用QTRAP-UPLC-MS/MS技术，利用其高灵敏度及准确的二次定性特点，对海产品中邻酪氨酸和间酪氨酸作为辐照标识物进行鉴定，可准确对辐照海产品是否经过辐照进行判定。