多壁碳纳米管分散固相萃取净化在测定水产品中3 种微囊藻毒素的应用及与固相萃取法的比较

徐潇颖，刘 柱，梁晶晶，陈万勤，周 霞，罗金文*

（浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052）

水体出现富营养化现象时，藻类会大量繁殖，不仅可使水生生物死亡，其产生的次级代谢产物（如藻毒素），也会通过饮用水和水产品危害人类健康[1-4]。在水华藻类中，毒性最强、范围最广的是蓝藻，其广泛分布于江河、湖沼、海洋等水体中，在代谢过程中产生各种毒素，其中微囊藻毒素（microcystins，MCs）是危害最为严重的一类，具有强烈致癌作用[5-8]。MCs是一类有单环七肽的天然毒素，其主要结构为环D-丙氨酸-R1-R2-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸，通过两个可变的L-氨基酸（R1和R2）的更替及其构成氨基酸的去甲基化从而衍生出众多的毒素类型，至今为止，发现的异构体已超过了100 种[9-13]。肝毒性是MCs的主要毒性，MCs进入体内后，专一性地与肝细胞内的蛋白磷酸酶结合，当摄入的藻类毒素浓度低时，具有潜在的肝毒性和癌诱发活性，当摄入浓度高时，则会引起急性中毒，严重者导致肝细胞肿胀、坏死、甚至死亡。MCs构型中所含有的环状结构和间隔双键，使其能稳定存在于水体及蓝藻中。若水体受到MCs的污染，一方面会对饮用受到污染水的人群造成威胁；另一方面，MCs会在以浮游植物为食的淡水水产品（鱼、虾以及贝类等）体内进行富集[14-17]，食用受到污染的水产品亦对人类健康存在潜在威胁[18]。

近年来，水体富营养化导致的藻类毒素安全问题日益受到重视，所以饮用水中MCs的测定方法也日趋多样化，除了传统的酶联免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析法，还有液相色谱法[18-20]、液相色谱-串联质谱法[21-23]以及高分辨色谱分析法[24]等色谱分析方法。而水产品相比饮用水基质更复杂，所以需采用适当的前处理降低基质对分析过程中的干扰，不少学者[25-26]采用HLB进行净化，但净化过程耗时较长且成本较高；也有采用加速溶剂萃取法[27]，对水产品中的藻类毒素进行提取。目前已有研究发现，活性炭可以吸附藻类毒素，由于需要大量活性炭才能达到有效的吸附，而过量活性炭的使用对环境会造成不可避免的污染[28-29]。因此，本研究创新使用了碳纳米管作为吸附剂，利用其化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、成本低等优点，对水产品中的MCs进行富集，再结合高效液相色谱-串联质谱法进行定量分析。通过优化实验条件以达到较好的回收率，建立水产品中痕量MCs的高选择性和高灵敏度的精确分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲈鱼、鲢鱼、鳙鱼、河蚌、河虾等实验所用水产品购买于浙江杭州当地水产品市场。

多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）（纯度＞97%，直径20～40 nm，长度＞5 μm）深圳市纳米港科技有限公司；磁性多壁碳纳米管（magnetic multi-walled carbon nanotubes，mMWCNTs）制备过程为利用浓硝酸羧化后磁化[30]；羧基化碳纳米管（carbon nanotubes-COOH，CNTs-COOH）、氨基化碳纳米管（carbon nanotubes-NH2，CNTs-NH2） 中科时代纳米中心；Oasis HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美国Waters公司。

MCs标准品MC-YR（CAS：101064-48-6，（10±0.54）μg/mL）、MC-RR（CAS：111755-37-4，（10±0.50）μg/mL）、MC-LR（CAS：101043-37-2，（10±0.52）μg/mL） 香港Bepure公司；甲醇、乙腈（均为色谱级） 德国Merck公司；甲酸铵、乙酸铵（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲酸（质谱级） 美国Sigma Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

XR 30A液相色谱仪 日本Shimadzu公司；三重四极杆串联质谱仪（配有电喷雾离子源） 美国AB SCIEX公司；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司；氮气吹干仪 瑞典Biotage公司；涡旋混合器 上海琪特公司；酸度计 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters Cortecs C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温35 ℃；进样量2 μL；流动相：流动相为甲醇（A）和5 mmol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱程序：0～2 min，25% A；2～4 min，25%～80% A；4～6 min，80% A；6～9 min，80%～25% A。流速0.35 mL/min。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源，多重反应监测正离子扫描，电离电压5 500 V，离子源温度500 ℃，气帘气流速30 L/min，碰撞气流量50 L/min，化合物定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表1。

表1 多重反应监测模式下MCs的质谱条件Table 1 MS parameters for the analysis of microcystins under MRM mode

1.3.3 前处理

1.3.3.1 提取

准确称取2 g淡水产品的食用部分于50 mL离心管中，加入8 mL 80%甲醇溶液，均质器上以8 000 r/min混合1 min，然后超声提取5 min，以15 000 r/min离心5 min后，取上清液，重复提取1 次，合并上清液于20 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至刻度。

1.3.3.2 固相萃取（solid phase extraction，SPE）法净化

准确移取4.0 mL定容后的上清液转移至50 mL离心管中，用水稀释至40 mL，待SPE净化。HLB固相萃取小柱在使用前依次用甲醇和水各5 mL以1～2 mL/min流速淋洗活化后，将40 mL稀释液转移至HLB小柱上，控制流速1～2 mL/min；用5 mL 10%甲醇溶液溶液淋洗抽干后，用5 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于35 ℃氮吹至近干，最后用20%甲醇溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱仪测定。

1.3.3.3 分散固相萃取（dispersive solid phase extraction，DSPE）法净化

取上述提取液2.0 mL于50 mL离心管中用水稀释至20 mL后，加入40 mg碳纳米管后，涡旋振荡10 min，使含有MCs的样品与吸附剂充分接触混合后，5 000 r/min离心5 min（mMWCNTs可采用磁铁置于样品底部吸附），使吸附剂聚集于离心管底部，除去上清液。随后加入体积分数0.1%甲酸-乙腈洗脱液1.0 mL，超声混合10 min，5 000 r/min离心5 min后，过0.22 μm滤膜，进行高效液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 DSPE的条件优化结果

在室温条件下，向含有3 种MCs的空白鲈鱼基质溶液中分别加入CNTs-COOH、CNTs-NH2、MWCNTs以及自制mMWCNTs，对萃取条件进行优化。以3 种MCs的回收率为衡量指标选择最优的萃取条件，对实验过程中涉及的吸附剂用量、洗脱溶剂以及溶液pH值进行考察。

2.1.1 碳纳米管种类对回收率的影响

以不含目标物的鲈鱼为空白基质，分别采用4 种碳纳米管作为分散固相萃取吸附剂，对10 μg/kg加标水平下3 种MCs的回收率进行考察，结果见图1。结果表明，CNTs-COOH以及mMWCNTs对3 种MCs都有较好的吸附效果，回收率在90.2%～96.2%之间，而CNTs-NH2以及MWCNTs的回收率远低于前两者。主要是由于CNTs-COOH、mMWCNTs在基团功能化中都带有羧基，而羧基在净化过程中的酸性（洗脱）条件下带正电荷，对带有两个可变氨基酸的MCs可以有效的吸附，而CNTs-NH2、MWCNTs在酸性条件下对MCs都存在部分吸附作用，致使回收率偏低，因此考虑mMWCNTs作为DSPE的吸附剂。

图1 不同碳纳米管对3 种MCs回收率的影响Fig. 1 Recoveries of 3 MCs by using different CNTs

2.1.2 mMWCNTs添加量对回收率的影响

分别称取5、10、20、50、100 mg mMWCNTs吸附剂，加入20 mL含有3 种MCs（质量浓度均为10 μg/L）的混合对照品基质溶液中，使mMWCNTs与含目标物的溶液充分混合后，在相同的条件下进行洗脱，比较不同质量吸附剂对MCs的回收率，结果见图2。在5～20 mg范围内，随吸附剂添加量的增大，3 种MCs的回收率都呈增加趋势，20～50 mg时增加趋势变缓慢，大于50 mg后，目标物的回收率不再随吸附剂的增加而增大。因此，选择40 mg作为mMWCNTs的添加量。

图2 mMWCNTs添加量对MCs吸附的影响Fig. 2 Effect of mMWCNTs addition on microcystins adsorption

2.1.3 不同洗脱剂对回收率的影响

图3 不同洗脱剂对MCs洗脱的影响Fig. 3 Effects of different eluents on microcystins recovery

分别对甲醇、乙腈、0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液4 种洗脱剂的洗脱效果进行考察，由图3可知，乙腈较甲醇的洗脱效果更优，在洗脱溶剂中加入0.1%甲酸与不加甲酸进行比较时，发现相同溶剂中，加入甲酸的洗脱回收率较高，其中采用0.1%甲酸-乙腈溶液洗脱mMWCNTs吸附的MCs回收率在92.3%～95.5%之间，主要是由于MCs分子存在两个自由的、可离子化的羧基和一个自由的氨基，这决定了生物分子MC-LR、MC-YR、MC-RR的带电情况。因此酸性洗脱液促进了多肽羧酸基团的质子化，使目标物更容易被洗脱，所以选择0.1%甲酸-乙腈溶液为最终洗脱剂。

2.2 不同净化方式下MCs的方法学实验结果

取混合标准储备液使用鲈鱼空白基质制备溶液进行逐级稀释，得到1～50 μg/L的系列标准溶液，以目标物的峰面积Y为纵坐标、质量浓度X为横坐标进行线性拟合，各化合物的线性范围如表2所示，在1～50 μg/L范围内线性关系良好，其相关系数均在0.99以上。

采用外标法定量，在鲈鱼的空白基质中添加不同浓度的待测物，应用1.3.3节的前处理方法，以信噪比为3确定各目标化合物在不同方法中的检出限，信噪比为10确定各目标化合物的定量限，结果见表2。3 种MCs在不同净化方式得到检出限分别为0.1、0.2 μg/kg，可以达到对水产品中痕量藻毒素检测的灵敏度。

表2 不同净化方式下3 种MCs的标准曲线、相关系数和检出限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 MCs

表3 不同净化方式下MCs的回收率与RSD（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of microcystins from spiked fish sample using different clean-up methods (n= 6)

以未检出3 种藻类毒素的鲈鱼为空白样品进行3 个不同含量（0.5、2、10 μg/kg）的加标实验，按1.3.3节中所述前处理方法，每个含量设定6 个平行，分别对2 种不同的净化方式进行考察，结果如表3所示。结果表明，采用HLB获得的回收率为90.8%～96.7%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.2%～3.0%，相比于DSPE，该方法更为稳定，且回收率较高，但成本较高、净化步骤繁琐、操作过程费时。DSPE回收率为88.7%～95.5%，略低于SPE法，但可以有效地将采用SPE法时每个样品成本降低至10%以内，并将缩短净化时间至原来的1/2。

2.3 不同基质中MCs的回收率与精密度

采用不同的净化方式在不同基质的空白水产品中进行2 μg/kg的加标实验，实验结果如表4所示，采用不同净化方法时，HLB固相萃取柱获得的回收率在89.6%～96.3%之间，且RSD均不大于2.8%，而采用DSPE获得的回收率较低，RSD大。在不同基质中，以鱼为基质获得的加标回收率要略高于另2 种基质，主要是由于贝类和虾中的蛋白含量较高，含水量较低，当加入80%甲醇溶液进行提取时，基质中蛋白变性，进而导致提取回收率下降。

表4 不同基质中MCs的回收率与RSD（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of microcystins in different matrixes spiked at 2 μg/kg (n= 6)

2.4 实际样品的测定结果

在2017年7月浙江省杭州地区附近水域采集60 个水产样品，包括鲢鱼、鳙鱼、河蚌、河虾等常见的水产品。去除不可食用部分，匀浆后进行测定。结果表明，确有少数水产品中存在藻毒素，其中MC-LR检出量在0.28～0.77 μg/kg之间，检出率为10%，而MC-RR的检出值为0.32～0.58 μg/kg，检出率为6.7%，MC-YR未见检出，有检出的样品主要为鱼类和河虾。对有检出样品进行两种净化方式比较，结果差异不显著，说明DSPE净化也可对水产品中的MCs进行测定。

3 结 论

对4 种不同性质的碳纳米吸附剂进行考察，并通过单一变量法对碳纳米吸附剂的添加量以及不同洗脱溶剂的考察，最终确立了以40 mg的mMWCNTs为分散固相萃取吸附剂对含有MCs的提取溶液进行吸附后，利用0.1%甲酸-乙腈溶液进行洗脱，能获得较好的回收，回收率在88.7%～95.5%之间，RSD均小于4.2%，而HLB回收率为89.6%～96.7%，但其节约时间以及耗材成本低，检出限能够满足我国标准控制要求，且在对不同基质的回收率及精密度考察中，具有较好的适用性，回收率水平均在88.1%以上，为水产品中MCs的测定提供了新方法。