miR-320a靶向Rab11a调控非小细胞肺癌细胞增殖的研究

石少敏,赵建军，于杜鹃,宋玉明

(吉林大学中日联谊医院 呼吸内科,吉林 长春130033)

非小细胞肺癌(NSCLC)是临床常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居我国所有恶性肿瘤首位[1]。尽管以吉非替尼、恩度等为代表的新型靶向药物在NSCLC治疗中取得令人鼓舞的成效，但NSCLC患者的远期生存率仍不尽如人意[2]。因此，进一步探索NSCLC的发病机制，提高NSCLC的临床疗效是临床亟待解决的问题。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，可通过靶向调控肿瘤发生发展过程中多个关键基因，参与细胞增殖及凋亡等病理生理过程，是肿瘤的潜在治疗靶点[3]。miR-320a是新发现的miRNA成员，定位于人体染色体8p21.3上[4]。研究表明miR-320a在NSCLC的发生发展中起到类似抑癌基因的作用，但其分子机制尚未完全明确[5]。Rab11a属于Rab小分子GTP酶家族的成员，是内吞再循环过程中的关键因子。既往研究证实，Rab11a表达变化可明显影响肿瘤细胞增殖与凋亡，提示调控Rab11a表达可能是NSCLC靶向治疗的新思路[6]。课题组前期利用miRNA靶基因预测软件证实，miR-320a与Rab11a存在结合位点，提示二者可能具有靶向关系。但miR-320a是否可通过靶向Rab11a调控NSCLC细胞增殖尚未可知。本研究旨在探讨miR-320a靶向Rab11a对NSCLC细胞增殖的影响，以期为临床诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料人非小细胞肺癌细胞系A549购于美国模式培养物集存库(ATCC)；RPMI1640培养基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清购于Gibco公司；MTT试剂盒购于博士德生物有限公司；Rab11a单克隆抗体购于美国Abcam公司；双荧光素酶试剂盒购于美国Promega公司；Annexin V-FIFC细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物；Neg-miR、si-Rab11a、pre-miR-320a、anti-miR-320a购于Ambion公司。

1.2细胞分组常规复苏A549细胞，将细胞重悬浮于含有1%双抗+10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、5% CO2恒温培养。收集对数生长期的A549细胞并接种于6孔培养板中，调整细胞浓度为5×105个/孔，细胞随机分为4组，即Neg-miR组、si-Rab11a组、pre-miR-320a组、anti-miR-320a组，各组分别转染Neg-miR、si-Rab11a、pre-miR-320a、anti-miR-320a，之后细胞继续培养24 h，转染结束后进行后续实验。

1.3双荧光素酶报告基因实验运用生物学信息软件预测miR-320a的靶基因为Rab11a(http:/ /www.targetscan.org/)。以人非小细胞肺癌细胞基因组DNA为模板，构建野生型Rab11a 3’-UTR(Rab11a-wt)质粒、突变型Rab11a 3’-UTR(Rab11a-Mut)。收集对数生长期的A549细胞，调节细胞密度至2×105cells/well，将Rab11a-wt、Rab11a-Mut与Neg-miR或pre-miR-320a共转染至A549，将细胞37℃、5% CO2恒温培养48 h；测定细胞荧光素酶活性，海肾质粒荧光值作为内参。

1.4Rab11a蛋白表达检测收集各组细胞，提取细胞蛋白，测定样品蛋白浓度，取适量样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，将膜置于5%封闭液4℃封闭4 h，后依次加入Rab11a单克隆抗体(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。

1.5细胞增殖活性检测收集各组细胞，将细胞置于37℃、5% CO2恒温培养，分别于培养24 h、36 h及72 h时，离心弃上清每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，继续37℃、5% CO2恒温培养4 h，离心弃上清，加入DMSO(100 μl/每孔)，振荡至结晶物充分溶解，采用全自动酶标仪测450 nm处吸光值(OD值)。

1.6统计学方法采用SPSS20.0对数据进行统计学分析，计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示，组间比较用单因素方差检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1验证miR-320a对Rab11a的靶向作用

生物信息学工具网站http://www.microRNA.org检测结果显示，miR-320a与Rab11a 3’UTR之间存在结合位点(见图1A)。双荧光素酶报告基因检测结果显示，pre-miR320a与Rab11a-WT共转染后细胞荧光活性显著低于Neg-miR与Rab11a-WT共转染(P<0.05)；pre-miR-320a或Neg-miR与Rab11a-MUT共转染后细胞荧光活性比较无统计学差异(P>0.05)(见图1B)。

(1A为miRNA靶基因预测软件检测结果；1B为双荧光酶素检测试验结果)

注：aP<0.05，与Neg-miR组比较

图1双荧光素酶报告基因实验验证miR-320a对Rab11a的靶向作用

2.2Westernblot检测Rab11a蛋白表达

Western blot结果显示，转染pre-miR-320a和si-Rab11a后Rab11a蛋白表达显著降低(P<0.05)，转染anti-miR-320a后Rab11a蛋白表达显著增高(P<0.05)(见图2)。

2.3MTT法检测细胞增殖

MTT结果显示，转染pre-miR-320a和si-Rab11a后细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，转染anti-miR-320a后细胞增殖活性显著增高(P<0.05)(见图3)。

注：aP<0.05，与Neg-miR组比较；bP<0.05，与si-Rab11a组比较；cP<0.05，与anti-miR-320a组比较

图2各组Rab11a蛋白表达比较

图3 各组细胞增殖活性比较

3 讨论

miR-320a已被证实参与多种恶性肿瘤的发生与发展[8]。Yang等[9]研究发现，浸润性乳腺癌组织中miR-320a表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及远处转移有关(P<0.05)，且miR-320a表达越低者总体生存时间越短。李沛等[10]研究显示，利用慢病毒转染技术上调结肠癌细胞中miR-320a表达水平，可显著抑制细胞中β-catenin、Vimentin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白表达，同时抑制细胞增殖活性、侵袭能力及转移能力。Zhang等[11]研究表明，NSCLC组织中miR-320a表达显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。上述研究提示，miR-320a在包括NSCLC在内的多种恶性肿瘤细胞中均发挥类似抑癌基因的功能，但其作用机制尚未完全明确。

受体介导的胞吞作用是动物细胞从胞外摄取大分子物质的重要方式[12]。Rab11a作为胞吞再循环的关键因子，参与物质胞内运输、循环过程。研究发现，Rab11a参与恶性肿瘤的发生发展，其机制可能与Rab11a调控肿瘤细胞胞内运输有关[13]。Dong等[14]研究证实，Rab11a在NSCLC组织中高表达，且其高表达与TNM分期、淋巴转移及预后不良有关(P<0.05)；过表达Rab11a可显著促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，同时抑制细胞凋亡。上述研究提示，Rab11a可能是NSCLC基因治疗中的一个重要靶点。本研究结果显示，转染pre-miR-320a可显著下调A549细胞中Rab11a表达，而转染anti-miR-320a则可显著上调A549细胞中Rab11a表达，提示miR-320a与Rab11a之间存在某种负向调控机制。进一步利用基因软件预测和双荧光素酶报告基因实验证实，miR-320a可通过作用于Rab11a 3’UTR，实现对Rab11a的靶向作用。本研究还观察到，转染pre-miR-320a后，且随着Rab11a表达的降低，A549细胞增殖活性显著降低，提示过表达miR-320a可通过靶向抑制Rab11a调控NSCLC细胞增殖，反之亦然。故推测，miR-320a靶向调控其下游靶基因Rab11a是其介导NSCLC细胞增殖的主要分子机制。

综上所述，miR-320a可通过靶向Rab11a调控NSCLC细胞增殖。但miR-320a是否还通过靶向其他多个下游靶基因参与NSCLC的发生与发展？尚未可知，仍有待进一步深入研究。