血管紧张素Ⅱ体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞心肌样细胞分化研究

邢玉洁，朱火兰，朱舜明，张荣怀，崔倩卫，刘小祥，王军奎

陕西省人民医院心内一科(西安 710068)

主题词 血管紧张素Ⅱ @心肌样细胞 骨髓间充质干细胞 动物，实验 大鼠

缺血性心脏病是一种对人类健康能够造成严重危害的疾病，目前的发病率也在不断的增加[1]。面对药物治疗的局限性，近年来兴起的细胞移植术为治疗缺血性心脏病带来了希望，这项技术的应用能够使坏死的心肌得以修复，提高心脏功能[2]。目前，这项技术多选用各种干细胞，而BMMSCs是其中研究比较广泛的一种干细胞[3-4], 有相关报道指出血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)在诱导BMMSCs分化为心肌细胞的过程中占据十分重要的作用[5]。本实验拟观察血管紧张素Ⅱ对大鼠BMMSCs向心肌细胞分化的可行性及有效性。

材料和方法

1 主要实验试剂和实验动物 AngⅡ ( Sigma, USA), Ficoll 淋巴细胞分离液(1.077 g/ml, TBD公司)，胎牛血清(Gibco, USA), MTT (Sigma，USA)，L-DMEM 培养基(Hyclone, USA)，胰蛋白酶(Sigma, USA)，Hoechst 33258 (Sigma, USA)。4周龄、质量约为80～100 g的健康雄性SD大鼠，购于西安交通大学医学院动物实验中心。

2 实验方法

2.1 BMMSCs的分离与培养：SD大鼠断颈处死后取双下肢长骨，在培养皿中将股骨、胫骨分别分离出来，然后酒精(75%)消毒5 min。消毒结束后，用培养液多次冲洗股骨、胫骨的骨髓腔，收集冲洗液，然后加入淋巴细胞分离液(1.077 g/ml)，开始离心(2000 r/min，20 min)。离心完毕后，可以看到分为三层，用吸管将中间云雾状的有核细胞层吸出,然后加入不完全培养液进行离心(1500 r/min，10 min)，之后用完全培养液重悬后于25 cm2的培养瓶中接种, 最后置于5%CO2的孵箱中培养。隔3 d换1次液，到80%细胞聚集时，按照1∶2比例传代，传到第3代备用。

2.2 BMMSCs的诱导分化：选用第3代BMMSCs，对照组只加入基本的培养基，试验组加入AngⅡ (0.1μmol/L) 诱导。诱导24 h后，用吸管将诱导液轻轻的吸弃，然后分别添加完全的培养基，3 d换液1次，共培养4周。

2.3 形态学鉴定：在BMMSCs的分离培养及Ang Ⅱ诱导前后，在倒置相差显微镜下进行密切观察，重点记录细胞的生长及形态学的改变。

2.4 MTT法检测细胞活性并描绘细胞增殖曲线：将第三代BMMSCs以1×105/ml接种于24孔板中，分为两组，每组12孔，每孔接种细胞悬液200 μl。培养24 h之后进行诱导，试验组加入含Ang Ⅱ 的诱导培养基，对照组只加入基本的培养基。于1、3、5、7 d在每孔加入MTT溶液20 μl (浓度5 mg/ ml)，孵育4 h后吸弃各孔内的上清液，然后加入DMSO150 μl，振荡10 min，最后在酶联免疫检测仪上选择490 nm的波长进行比色，测定各孔的光吸收值(A)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制增殖曲线。

2.5 免疫荧光染色：将诱导4 周后的细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定，山羊血清封闭30 min，cTnI抗体4 ℃过夜，然后加入二抗(FITC标记)避光染色40 min，最后用Hoechst 33258孵育10 min，甘油封片后荧光显微镜下拍照。

2.6 流式细胞检测：调整诱导4 w后的细胞密度达到1×106个/ml, 加入cTnI抗体染色1h，再加入二抗避光染色40 min，然后40 g/L多聚甲醛固定20 min，最后流式细胞仪检测，计算染色阳性的细胞数占总细胞数的百分率。

2.7 透射电镜：离心使诱导4w后的细胞成团，于4 ℃用3%戊二醛前固定2 h，再进行后固定(1%四氧化锇，2 h)，然后依次进行漂洗、梯度脱水、包埋(按照环氧丙烷∶包埋剂=1∶1比例配置)、切片和铅铀染色，并于透射电镜下拍照。

结 果

1 BMMSCs的形态学变化 BMMSCs原代培养后具有较强的折光性，形状为圆形 (图1A)。培养3天后形态呈多样化，可见短纺锤形，也可见三角形的、星形的或是扇形的(图1B)。与原代细胞相比，传代后细胞的体积增大，大多数呈梭形, 偶有一些呈多角形或三角形(图 1C)。经过Ang Ⅱ诱导后，主要表现为细胞体积逐渐增大，4周以后细胞形状变为长梭形，而且排列均一、整齐(图 1D)。

A : 初次分离的BMMSCs (×100倍); B:原代培养第3d的BMMSCs(×100倍);C:传代培养的BMMSCs(×200倍); D: Ang Ⅱ诱导4周的BMMSCs沿细胞长轴呈一致性排列(×400倍)

图1 AngⅡ诱导大鼠骨髓间充质干细胞

不同时间段细胞形态的变化

2 细胞增殖能力检测结果 MTT法检测结果显示：在第3d两组细胞的增殖能力被抑制，此后再逐渐变强(图2)。且AngⅡ组细胞的增殖能力较对照组明显增强。

图2 细胞的增殖曲线

3 免疫荧光染色结果 经AngⅡ诱导的BMMSCs第4周阳性表达cTnI, 细胞质呈现绿色荧光，而细胞核呈现蓝色荧光(图3)。而对照组的细胞cTnI为阴性表达。

A：被AngⅡ诱导的细胞表达cTnI，呈绿色荧光(×200)；B：细胞核被Hoechst33258染色，呈蓝色荧光(×200)；C：图A与图B合并后呈图C(×200)

图3 AngⅡ诱导4周后cTnI荧光染色

4 流式细胞仪检测结果 流式细胞仪检测结果示：在对照组中FITC阳性细胞占细胞总数 (1.0±0.2) %，在AngⅡ组中 FITC阳性细胞占细胞总数 (25.3±2.2) %。AngⅡ组心肌样细胞诱导分化率较对照组显著增高，差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

注：与对照组比较，*P<0.05图4 经AngⅡ诱导4周后细胞诱导分化率检测结果

5 透射电镜结果 透射电镜结果示：经过AngⅡ诱导的BMMSCs细胞器聚集在核周围，含有大量内质网和线粒体，还有Z线样物质、肌丝 (图5)。而对照组未见Z线样物质和肌丝。

注：细箭头所示为肌丝，粗箭头所示为Z线样物质图5 透射电镜检测结果(×80K)

讨 论

众所周知，5-氮杂胞苷可诱导BMMSCs分化为心肌样细胞[6]，然而其本身具有一定的毒性，诱导率也不是很高，所以临床有效性和安全性不是十分明确。因此，目前迫切需要寻找一种药物，既具有安全性又具有有效性，而且还要有较高的诱导分化率。有学者指出，Ang Ⅱ可在体外诱导人BMMSCs分化为心肌样细胞，但此方面的研究相对较少，且其具体的诱导分化有效性也不十分明确。

AngⅡ属于肽类激素，也是一种生长因子，具有调节血管张力和水钠代谢的作用，还可以刺激成纤维细胞和血管平滑肌细胞的增殖。研究表明：AngⅡ是血管平滑肌细胞强大的丝裂原，能够通过旁分泌或自分泌方式去刺激血管平滑肌细胞，使其蛋白质和DNA的合成增加，进而使细胞的数目增多[7]。此外，在碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子的合成与释放中，AngⅡ发挥促进作用，最终可引起血管平滑肌细胞分裂和增殖增加[8-9]。因此，本实验选择 Ang Ⅱ作为诱导剂，期望能够促进BMMSCs分化为心肌样细胞。通过MTT检测示，AngⅡ组细胞的增殖能力优于对照组，表明AngⅡ可以诱导且促进BMMSCs向心肌样细胞的增殖与分化。

肌钙蛋白(Troponin, Tn)一般位于收缩蛋白的细肌丝上，它是一种调节肌肉组织收缩的蛋白，包括TnI、TnT和TnC三个亚单位。cTnI是一种心肌特异性蛋白，对于鉴定心肌细胞具有很强的特异性。在我们的研究中，通过免疫荧光染色发现在Ang Ⅱ诱导组细胞cTnI表达阳性, 而在对照组cTnI表达则呈阴性，这表明我们通过Ang Ⅱ诱导的BMMSCs包含了心肌特异性蛋白。

此外，我们通过MTT检测显示：AngⅡ组细胞的增殖能力显著高于对照组。流式细胞仪检测结果显示：AngⅡ组心肌样细胞诱导分化率显著高于对照组[(25.3±2.2)% vs (1.0±0.2)%]。且AngⅡ诱导后的细胞可见肌丝、Z线样物质,符合心肌细胞超微结构。以上结果均说明我们成功用AngⅡ诱导BMMSCs分化为心肌样细胞，且诱导分化率较高。

尽管取得了以上结果，但Ang Ⅱ的作用机制仍然不是很明朗[10-11]。包括 Ang Ⅱ在内的多种细胞因子与其相应受体结合，导致ERK信号通路被激活，进一步增加了一些早期的即刻基因如erl-1、c-fos、c-jun等表达[12]。也有观点认为，细胞TGF-β1基因和TGF-β受体基因的表达能够被Ang Ⅱ增强[13], 而MAPK、PKA以及PKC等细胞信号通路又可因TGF-β基因表达增强而被激活。此外，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的水解也与Ang Ⅱ激活磷脂酶C有关，最终生成二酰甘油 (Diacyl glycerol , DG)与肌醇1 ,4 ,5-三磷酸 (Inositol trisphosphate , IP3 )[14]，这两者作为第二信使进一步激动两条信号通路：即IP3/Ca2+及DG/PKC信号通路，参与调节一些生理过程。因此，AngⅡ诱导 BMMSCs分化为心肌样细胞可能与其能够使多条信号转导通路得以活化有关，也或许与其分泌一些诱导因子有关, 但是确切的机制尚需深入探讨。

综上所述，本实验发现AngⅡ可以诱导BMMSCs向心肌样细胞分化，分化的细胞具有心肌细胞的特性，且诱导分化率高。这为推动应用BMMSCs治疗心力衰竭等心血管疾病提供了一种新的策略。