肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量检测及其与肿瘤增殖、侵袭的关系研究

黄朝友，李 响，赖 飞 ，杨 振， 钱友良

1.成都市第二人民医院泌尿外科(成都 610017)，2.四川大学华西医院泌尿外科(成都610041)

主题词 @肾母细胞瘤 @Par-4基因 基因表达

肾母细胞瘤是一种胚胎恶性肿瘤，又被称为Wilms瘤，是目前儿童第二位常见的腹部恶性肿瘤，98%以上的病例发生于10岁以下，其中3岁以下儿童更为多见[1-2]。Par-4基因首先在前列腺癌细胞中被发现，目前在结直肠癌、肝癌等多种恶性有组织中呈异常表达，可能通过影响癌细胞增殖、侵袭的方式来参与肿瘤的发生发展[3-4]。目前Par-4基因在肾母细胞瘤中扮演的角色未明，本次研究对比活检正常组织、肾母细胞瘤组织中该基因表达量的差异，并进一步探讨该基因表达与后续增殖、侵袭相关基因表达量的内在联系，以期明确Par-4基因对肾母细胞瘤发生发展的影响，为后续临床治疗实践提供参考。

资料与方法

1 一般资料 选取2014年1月到2017年1月间在本院确诊肾母细胞瘤的患者60例作为研究对象，其中，男性32例，女性28例，年龄1～8岁，平均(3.72±0.96)岁。医院伦理委员会批准此次研究实施。纳入标准如下：①活检组织经病理确诊为肾母细胞瘤/正常肾脏组织；②首次确诊疾病、既往未接受相关治疗；③家属签署知情同意书。排除标准：①合并严重先天性疾患；②合并严重全身感染性疾病；③合并其他组织脏器肿瘤性疾病。

2 Par-4基因表达量检测 取肾脏病灶及瘤旁正常组织活检标本，采用荧光定量PCR法检测其中Par-4基因表达量，具体步骤如下：①细胞裂解；②4 ℃下12 000rpm离心，分离上层无色水相；③沉淀总RNA并清洗、干燥；④分析总RNA纯度及浓度；⑤使用反转录试剂盒合成样品cDNA；⑥使用荧光定量PCR试剂盒合成目标基因。设置瘤旁组织中Par-4基因表达量为标准值100，计算肾母细胞瘤组织中该基因的对应表达量。

3 增殖、侵袭相关基因表达量检测 同样取肾脏病灶及瘤旁正常组织活检标本，采用荧光定量PCR法检测其中增殖相关基因：IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β、PTEN；侵袭相关基因：Axin、Ki-67、E-cad的表达量，方法同2。

4 统计学方法 采用 SPSS 25.0统计学软件，Par-4基因表达量、增值及清洗相关基因表达量 采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Par-4基因表达量 瘤旁组织中Par-4基因表达量为100，肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量为(62.18±7.05)。肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量显著低于瘤旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 增殖相关基因表达量 肾母细胞瘤组织中增殖相关基因IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β mRNA的表达量高于瘤旁组织，PTEN mRNA的表达量低于瘤旁组织，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 不同组织中增殖相关基因表达量的比较

3 侵袭相关基因表达量 肾母细胞瘤组织中侵袭相关基因Axin、E-cad mRNA的表达量低于瘤旁组织，Ki-67 mRNA的表达量高于瘤旁组织，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 不同组织中侵袭相关基因表达量的比较

4 相关性分析 经Pearson检验发现，肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量与增殖相关基因IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β基因表达量呈负相关，与PTEN基因表达量呈正相关；与侵袭相关基因Axin、E-cad基因表达量呈正相关，与Ki-67基因表达量呈负相关(P<0.05),见表3。

表3 Par-4基因表达量与瘤细胞恶性生物学行为的相关性

讨 论

肾母细胞瘤起源于未分化的后肾胚胎，在幼龄儿童中最为常见，其生长十分迅速、恶性程度高。肾母细胞瘤的治疗缺乏特效手段及靶向药物，探索调控癌细胞恶性生物学行为的“分子开关”，可能为远期该病治疗提供新思路。Par-4基因是在前列腺癌大鼠癌细胞中发现的一类具有促进肿瘤细胞凋亡的基因，其作用的实现包括:①直接诱导细胞凋亡；②增加癌细胞对外界凋亡信号敏感性两方面[5-6]。Par-4基因在肾母细胞瘤中扮演的角色尚未有明确定论，本次研究取肾母细胞瘤患者的活检组织，对比病灶组织、瘤旁组织中该基因表达量的差异，结果发现：与瘤留旁组织比较，肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量较低，说明Par-4基因异常低表达参与肾母细胞瘤发生。

肿瘤细胞恶性增殖是该疾病最突出的生物学特征，探索肾母细胞瘤相关增殖分子表达情况，有助于阐明疾病发生机制。IGF-Ⅱ是结构及功能上与胰岛素类似的生长因子，已经在国内外研究中被证实可调节细胞有丝分裂，在正常细胞及癌变的肿瘤细胞中均发挥重要调节作用，可促进肿瘤细胞增殖[7-8]。IRS-2可调控葡萄糖代谢，在细胞有丝分裂中也扮演重要角色，已经在神经母细胞瘤、乳腺癌、间皮细胞瘤中发现该分子介导的信号传导通路可促进肿瘤细胞增殖转移[9]。TGF-β通过与其特异性受体结合、激活下游分子Smad并发生磷酸化，可进入细胞核调节多种基因转录、促进肿瘤细胞增殖[10-11]。PTEN是近年新发现的肿瘤抑制基因，属于PI3K/AKT信号通路的内源性负性调控蛋白，经阻断PI3K/AKT信号通路实现抑癌作用[12-13]。文中对比不同组织中上述增殖相关基因表达量的差异，结果发现：与瘤旁组织比较，肾母细胞瘤组织中IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β的表达量较高，PTEN的表达量较低，这与肾母细胞瘤的无限增殖活性吻合。进一步经Pearson检验发现，肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量与IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β基因表达量呈负相关，与PTEN基因表达量呈正相关，证实Par-4基因可负调控肾母细胞瘤细胞的增殖活性。

肿瘤细胞的远处转移主要由侵袭相关基因介导，肾母细胞瘤中也存在较多侵袭相关基因的异常表达，检测其具体表达量可间接判断肿瘤恶性程度。Axin是一种肿瘤抑制因子，通过下调β-catneni水平而发挥抑癌作用，已经在原发性肝癌及结肠癌细胞中发现其异常低表达[14-15]。Ki-67在静止细胞中不表达，、特异性存在于增殖细胞中，已经在膀胱癌、胃癌、大肠癌中发现该基因过量表达，且其表达量与淋巴结转移与否、治疗预后密切相关[16]。E-cad是调节细胞间、细胞与基质之间粘附反应的重要媒介，在维持组织结构形态方面发挥重要作用，其表达量与肿瘤细胞的分化状态及肿瘤转移潜能直接相关。E-cad基因表达量降低，可能是肿瘤细胞恶性程度高、侵袭扩散能力强的重要标志。本次研究对比不同活检组织中上述侵袭相关基因表达量的差异，结果发现：与瘤旁组织比较，肾母细胞瘤组织中Axin、E-cad基因表达量较低，Ki-67基因表达量较高，说明促侵袭基因的高表达、抗侵袭基因的低表达共同参与肾母细胞瘤细胞的恶性行为。进一步经相关性分析，发现：肾母细胞瘤组织中Par-4基因基因表达量与Axin、E-cad基因表达量呈正相关，与Ki-67基因表达量呈负相关，证实Par-4基因可负调控肾母细胞瘤细胞的侵袭活性。

综合上文所述，肾母细胞瘤组织中Par-4基因表达量异常下降，对肿瘤细胞的增殖及侵袭活性发挥负调控作用，有望成为远期该疾病基因治疗的新靶点，有待后续研究进一步深入探讨。