基质金属蛋白酶2/9在大鼠颈动脉迂曲形成中的发生机制研究*

支伟伟，苏 哲，殷 强

1.西安市第三医院心胸外科(西安 710018)，2.空军军医大学唐都医院(西安 710038)，3.空军军医大学西京医院 (西安 710032)

主题词 细胞增殖 基质金属蛋白酶2 基质金属蛋白酶9 @动脉迂曲 动物，实验 大鼠

动脉迂曲是一种常见的异常血管形态[1-4]。最近的临床研究表明，动脉迂曲与高血压、衰老、动脉粥样硬化、遗传缺陷等多种疾病相关[5-7]。因此，动脉迂曲的发生及生物学效应越来越受到关注。

基质金属蛋白酶(MMP)调节血管壁重构。研究发现，MMP-2与纤维蛋白生成有关，而MMP-9与纤维蛋白溶解有关，MMP-2/9之间的动态平衡对于维持正常的血管形态具有重要的作用[8-9]。然而，MMP-2/9在动脉迂曲形成中发挥怎样的作用尚不清楚。

材料与方法

1 动物材料及分组 本实验选用SD大鼠16只，雌雄不拘，随机分为对照组和动脉迂曲组，每组8只。对照组的大鼠左侧颈动脉切断后原位缝合；动脉迂曲组的大鼠参照文献，大鼠右侧颈动脉切取1 cm左右的动脉段，将动脉段端端吻合于左侧颈动脉。大鼠均来源于第四军医大学动物所，且该研究符合第四军医大学实验动物使用伦理审查。

2 手术方法 参照文献进行，简述如下：动脉迂曲组大鼠，消毒铺单。正中切开大鼠颈部2～3 cm切口，显露并游离左侧颈总动脉，切取1 cm动脉段，放入生理盐水中备用。然后，显露游离右侧颈总动脉，切断颈总动脉。将左侧颈动脉段端端吻合于右侧颈总动脉。血管吻合采用间断缝合方式，一般缝合6～8针，手术结束后丝线闭合切口。对照组大鼠将左右两侧颈动脉分别切断后原位缝合，其余同实验组。术后对大鼠进行常规食物和水饲养1周。

术后1周取出移植动脉段。动脉段取出前24 h，行尾静脉注射BrdU(50 mg / kg)，标记新增殖的细胞。动脉段取出后用2%多聚甲醛(PFA，Sigma公司)固定过夜。并进行HE染色与免疫组化分析，检查细胞增殖与调控胞外基质重塑的基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9水平，对血管壁重塑进行评估。

3 BrdU染色 参照文献检测细胞增殖，简述步骤如下：切片(5 μm厚度)脱蜡后用10mmol/L柠檬酸钠缓冲液(Thermos Fisher 公司)煮沸。随后用0.5%的Triton X-100(Sigma公司)进行通透性处理，用10%的FCS-PBS封闭后于室温放置30～60 min。滴加抗鼠BrdU抗体(10%的FCS-PBS按1∶15稀释)并在37 ℃条件下孵育1 h。用PBS洗涤后，滴加抗鼠二抗(1%的FCS-PBS按1∶20稀释)并于 37 ℃条件下孵育1 h，同样用PBS洗涤。随后将切片用1 μg/ ml浓度的Hoechst 33258(Sigma公司)于37 ℃下复染30 min。

用荧光显微镜对细胞增殖进行观察，每个样品选取5个视野，分别用ImagePro对各个视野中BrdU阳性细胞和细胞核复染阳性细胞进行计数。依据BrdU阳性细胞占总细胞百分比对各视野细胞增殖率进行计算，取5个视野的均值为各样本细胞增殖率。

4 MMP-2和MMP-9的免疫组织染色 除所用一抗为鼠抗MMP-2及所用二抗体为Cy3标记羊抗鼠(Jackson immuores earch lab，PA)抗体外，MMP-2免疫组化染色程序与BrdU染色相同。每个样本同样选取5个视野进行拍照，所有拍照均采用5.31 s的曝光时间，用ImagePro对MMP-2表达的综合最佳密度(IOD)进行分析。除一抗为抗兔MMP-9，二抗为Cy3标记驴抗兔(Jackson immuo rese arch lab，PA)抗体外，MMP-9染色与分析流程与MMP-2相同[10-13]。

5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件，所有实验数据均采用均值±标准差的方式表示，用2-way ANOVA并结合Tukey的事后分析(JMP，SAS Institute Inc)进行统计分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 细胞增殖 动脉迂曲组在1周时与对照组相比，细胞增殖显著增加[动脉迂曲组(13.2±6.8)%，对照组(2.43±2.3)%](P<0.001，图1)。但发生弯曲的移植物内侧[(14.6±7.7)%]和外侧[(13.3±4.0)%]细胞增殖无统计学差异(P>0.05)。

2 MMP-2和MMP-9 与对照组相比，动脉迂曲组MMP-2的表达在第1周显著升高了4.2倍(P<0.001)，但MMP-9表达未发生显著增加(P= 0.63,图2)。

注：与对照组相比，*P<0.05

图1 移植物中细胞增殖检测

注：与对照组相比，* P<0.05

图2 移植物中的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和-9(MMP-9)水平分析

讨 论

动脉迂曲是一种常见的异常血管形态。近年来研究发现，动脉迂曲与高血压、动脉粥样硬化等密切相关。虽然针对动脉迂曲的研究较多，但是大部分局限于外科的解剖结构性的观察，对于动脉迂曲的发生机制目前尚不清楚[11-12]。

本实验结果显示血管屈曲模型在术后建立1周后，MMP-2表达和细胞增殖显著增加，这很可能是由于动脉弯曲引起的管壁应力和剪切应力改变所致。剪切应力和管壁应力可通过调控细胞增殖[13- 14]、凋亡[15]、粘附[16]和血小板聚集[17]。然而，术后1周MMP-9在屈曲动脉中的表达与对照组无明显差异，表明血管外侧未发生重塑[18]。

由于预算限制，本项目存在样本量小的不足。观察持续时间短是本项目的另一缺陷，弯曲的动脉可能需要更长的时间来适应并变得永久曲折。尽管存在上述不足，本研究仍成功构建了体内动脉弯曲模型，并对其在研究动脉壁重塑中的可行性进行了评估，弯曲动脉的长期适应性将是未来我们研究的重点。此外，该模型有望改造为静脉移植模型并用以静脉屈曲重塑研究。

总之，从左到右的大鼠颈动脉移植是研究屈曲动脉壁重塑的良好动物模型。MMP-2相关研究有望阐明动脉屈曲的发展过程与机制。