蓬乱蛋白2对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响

高小博 王译晗 朱海英 张 辰 马 旭 陆彩玲∗

1.国家卫生计生委科学技术研究所遗传优生中心(北京,100081);2.北京协和医学院研究生院

先天性心脏病是我国排名首位的出生缺陷类型,占所有新生儿的8‰～10‰。[1]。先天性心脏病是造成心肌肥厚的重要因素之一[2]。目前已经鉴定许多调控心肌肥厚的信号通路,包括细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和蛋白激酶B(AKT)信号通路等[3-4]。Wnt信号在调控细胞命运以及随后的细胞行为中扮演重要作用,蓬乱蛋白(Dvl)是高度保守的Wnt信号家族的关键成员,在人和小鼠中发现3种Dvl蛋白Dvl1,Dvl2,Dvl3[5-8]。Malekar等[9]报道心脏特异性过表达Dvl1的转基因小鼠心脏体重比增大,左心室扩张,心肌细胞面积增大,出现明显的心肌肥厚表型。Dvl2敲除的转基因小鼠有着严重的心血管流出道畸形,包括右心室双出口,大动脉转位和永存动脉干等[10]。然而,Dvl2在心肌肥厚中的作用尚未报道,在此本文研究了Dvl2基因对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂与设备

抗体:Anti-Flag,Anti-α-actinin,Anti-β-actin,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,2μg/ml),TRITC标记的抗小鼠Ig G荧光二抗购自sig ma公司;Antiβ-MHC购自Santa Cr uz公司;Anti-Phospho-p44/42 ERK1/2(Thr202/Tyr204),Anti-p44/42 ERK1/2,Anti-Phospho-AKT(Ser473),Anti-AKT,Anti-Dvl2购自Cell Signaling公司;辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔Ig G和山羊抗小鼠Ig G购自北京中杉金桥生物技术有限公司。重组腺病毒Ad-GFP和携带有Flag标签的Ad-Dvl2病毒购于山东维真生物科技有限公司。高效组织细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(Ther mo公司),增强化学发光(ECL)液(Millipore公司),DMEM/F12液体培养基(Hycl one公司),胎牛血清(Hyclone公司),胰酶细胞消化液(Beyoti me公司),5-溴脱氧尿嘧啶(5-Br du,Sig ma公司),血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,Sig ma公司),CO2恒温细胞培养箱(美国For ma公司),激光共聚焦显微镜(Zeiss,LSM 710),全自动酶标仪(Bio Tek,Gen5)。

1.2 原代心肌细胞培养

出生24 h内的SD大鼠乳鼠,经75%酒精消毒后迅速取出心脏,剪取心尖部心室组织,置于预冷的Hanks液中,洗净后将心脏剪成约1 mm3的碎块,加入消化酶3 ml,37℃消化2～3 min后,吸取上清至含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中终止消化。重复上述消化步骤至组织块基本透明状。将收集的细胞过120目细胞筛,1000 rp m离心15 min,弃上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞,37℃差速贴壁,2 h后收集上清液,1000 rp m离心10 min,弃上清,用含0.1 mmol/L 5-Brdu,10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞后按所需密度接种于培养板,置于37℃培养箱中进行培养。

1.3 细胞免疫荧光染色

将原代心肌细胞接种于铺有玻片的24孔板中,用重组腺病毒Ad-GFP和Ad-Dvl2分别感染细胞24 h,随后用生理盐水和AngⅡ分别处理细胞48 h。弃去培养基,PBS洗涤细胞2-3次,4%多聚甲醛室温固定0.5 h,0.5%Triton X-100(PBS稀释)透化10 min,5%BSA(PBS稀释)封闭1 h;1:200稀释的α-辅肌动蛋白(α-actinin)抗体,37℃孵育1 h或4℃过夜,PBS充分洗涤细胞;TRITC标记的抗小鼠Ig G荧光二抗(1:100)和DAPI(1:1000)于37℃孵育1 h,充分洗涤后置于载玻片,抗荧光猝灭剂封片,激光共聚焦显微镜观察、拍照记录,每组取约200个心肌细胞利用软件统计面积。

1.4 Wester n Bl ot检测方法

将原代心肌细胞接种到6孔板中,经处理后,收集细胞加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,13000 r p m离心15 min,收集细胞上清。利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度定量,12%SDS-PAGE分离蛋白,转印至硝酸纤维素膜上。用5%的脱脂牛奶封闭1 h后,分别用一抗4℃孵育过夜,TBST漂洗,随后用HRP标记的二抗室温孵育1 h,TBST漂洗后,ECL化学显影。实验中用β-actin作为内参基因,利用I mage J软件进行灰度定量分析。

1.5 统计学分析

数据分析采用Graph Pad Pris m 5.0软件进行统计学分析,实验结果用均数±标准差(¯x±s)表示,组间比较采用t-检验,p＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AngⅡ上调Dvl2的表达

用1μM AngⅡ处理大鼠原代心肌细胞48 h后,收集细胞样品进行Wester n Blot检测。与对照组相比,AngⅡ处理引起Dvl2的表达显著上调(图1 A),Dvl2蛋白水平约为对照组的2倍(图1 B)(p＜0.001)。

图1 AngⅡ处理后心肌细胞Dvl2的表达情况

2.2 Dvl2过表达对心肌细胞影响

为了探究Dvl2对心肌细胞肥大的影响,我们用重组腺病毒Ad-GFP和Ad-Dvl2分别感染原代心肌细胞,用Flag抗体进行 Wester n检测,结果显示Ad-GFP感染组未检测到阳性信号,而Ad-Dvl2感染组显著过表达Dvl2(图2C)。用Ad-GFP和Ad-Dvl2分别感染原代心肌细胞后进行AngⅡ处理,随后进行α-actinin免疫荧光染色并测量心肌细胞面积。结果如图2 A和2B所示,与生理盐水组相比,Ad-GFP感染组经AngⅡ处理后心肌细胞面积显著增大(p＜0.001)。与Ad-GFP对照组相比,Ad-Dvl2感染组显著增加了AngⅡ诱导的心肌细胞肥大(p＜0.001)。Wester n检测结果显示,与生理盐水处理组相比,AngⅡ处理后心肌细胞β-MHC的表达上调。与Ad-GFP感染组相比,Dvl2过表达促进了AngⅡ诱导的β-MHC表达的上调(图2C)。

2.3 Dvl2对AKT通路的影响

为了探究Dvl2促进AngⅡ诱导心肌细胞肥大的可能机制,我们检测了AKT和ERK1/2总蛋白和磷酸化水平。结果显示Ad-GFP感染组经AngⅡ处理后,与生理盐水组相比,AKT和ERK1/2磷酸化水平显著升高(图3A)(p＜0.001);Ad-Dvl2感染组与Ad-GFP对照组相比,AKT磷酸化水平显著升高(图3 A和3B),而ERK1/2的磷酸化水平没有明显变化(图3C)。

图2 Dvl2过表达对AngⅡ诱导的心肌细胞面积以及β-MHC表达的影响

图3 细胞AKT和ERK1/2总蛋白及磷酸化水平检测

3 讨论

Dvl家族是高度保守的Wnt信号家族的关键成员,Dvl1与Dvl2同属于Dvl蛋白家族。Wnt信号通路的异常激活与心肌肥厚、心衰、心律失常以及先天性心脏病等多种心脏疾病的发生有密切的联系[11-13]。Malekar等[9]研究发现心脏特异性过表达Dvl1转基因小鼠较野生型小鼠心脏明显肥大,心功能指数降低。Van等[14]报道显示敲除Dvl1能够抑制主动脉弓缩窄(TAC)引起的小鼠心脏体重比以及心肌细胞横截面积的增加,肥大指标心房利钠因子(ANF)和脑钠肽(BNP)水平的升高。本研究发现,大鼠原代心肌细胞经AngⅡ处理后,Dvl2表达上调,Dvl2过表达显著增强AngⅡ诱导的心肌细胞面积增大和肥大标志物β-MHC的表达增加,这些体外研究表明Dvl2能够促进AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

AKT和ERK1/2信号通路对心肌肥厚具有重要的调控作用。Hingtgen等[15]报道显示AngⅡ通过作用于AT(1)受体,以时间依赖性的方式激活AKT信号通路,利用显性负效应的AKT预处理心肌细胞能够逆转AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。ERK1/2是MAPK信号通路的重要组成部分,Bueno等[16]报道显示小鼠心脏特异性过表达 MAPK激酶MEK1后,ERK1/2通路被激活,心肌细胞面积增大,肥大相关指标ANF、BNP和β-MHC水平升高,而ERK1/2通路抑制剂能够逆转MEK1引起的心肌肥厚。本研究结果显示Dvl2过表达显著增加了AKT的磷酸化水平,而ERK1/2的磷酸化水平没有明显变化,提示Dvl2可能通过作用于AKT信号通路促进心肌细胞肥大。

Wnt信号分为经典的β-catenin依赖通路和非经典不依赖β-catenin通路两类。在经典的Wnt信号通路中,Dvl激活并被招募至细胞质膜上,抑制GSK-3β的活性,引起β-catenin复合物的解聚,导致β-catenin在胞质中积累并转位至细胞核内,随后激活基因表达。GSK-3β是心肌细胞肥大的负性调节因子[17-19]。研究报道有活性的GSK-3β可与APC,axin等蛋白形成复合体,在转录水平抑制肥大相关转录因子NFAT,GATA4,c-Myc的表达,从而抑制心肌肥厚[20-23]。另有文献报道显示,GSK-3β是AKT下游靶基因之一,AKT能够直接磷酸化GSK-3β,抑制其活性,从而促进心肌肥厚[24]。Van等[14]在研究中发现Dvl1敲除能够逆转TAC诱导的心肌肥厚,其机制可能与GSK-3β和AKT活性的改变有关。本研究发现,Dvl2过表达能够促进AngⅡ诱导的AKT信号通路的激活。提示Dvl2可能通过Wnt或AKT通路抑制GSK3β的活性调控心肌细胞肥大,具体的分子机制有待进一步的研究。

综上,本研究发现AngⅡ处理引起心肌细胞Dvl2的表达升高,Dvl2过表达引起AngⅡ诱导的心肌细胞面积和β-MHC表达的增加以及AKT信号通路的激活,表明Dvl2参与调控心肌细胞肥大,其作用机制可能与AKT信号通路相关。