Shh、Ptch1、Smo、Gli1在机械损伤大鼠子宫内膜的表达及意义

倪冬冬 徐祥波 贺 斌 王蔼明

1.第二军医大学(上海,200433);2.海军总医院;3.国家卫生计生委科学技术研究所

目前在临床上子宫内膜的机械性损伤是导致宫腔粘连的主要原因,常见为月经异常和继发性不孕[1]。随着宫腔镜技术的应用及宫腔内手术操作的增加,宫腔粘连的发病率和诊断率显著上升[2-3],宫腔粘连的本质是子宫内膜损伤后导致的子宫内膜纤维化[4]。目前研究已发现多种与子宫内膜纤维化发生相关的因素,但子宫内膜纤维化的发病机制仍不清楚[5]。因此研究子宫内膜损伤后的修复机制将为宫腔粘连的治疗方法研究提供理论依据。有研究表明,组织器官在损伤后的修复过程中会激活胚胎时期与组织器官发生发育相关的信号通路[4]。通过激活这些信号通路,实现组织器官细胞增殖修复组织结构以恢复其功能。Hedgehog(Hh)信号通路是胚胎时期的重要信号通路之一,该信号通路的激活能够促进多种组织的损伤修复,如皮肤[6]、心肌[7]、骨骼肌[8]以及肝脏的损伤后修复[9]等。本文对Hh信号通路在子宫内膜损伤后修复过程中的作用进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料来源

8周龄雌性Wistar大鼠(北京维通利华实验动物有限公司)24只,体重180g～220g,数字表法随机分为正常组(6只)及实验组(18只)。大鼠饲养于国家卫生计生委科学技术研究所实验动物中心,均自由进食正常饲料。大鼠实验操作均遵守国家卫生计生委科学技术研究所伦理委员会的相关规定。

1.2 模型建立及子宫标本取材

①实验组:将18只大鼠用2%戊巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉后行刮宫手术。分别取双侧子宫,在子宫角近卵巢约5 mm处剪开一小口,用自制刮勺探入宫腔反复搔刮子宫,至刮出子宫内膜碎屑宫腔面粗糙后,缝合子宫,逐层缝合关闭大鼠背部切口。分别于搔刮后24h、72h、7d各取6只大鼠用0.2%苯巴比妥麻醉后切除双侧子宫。②正常组:6只大鼠不进行任何干预,在实验组同等条件下饲养,实验第7天时麻醉后取双侧子宫。两组大鼠双侧子宫取出后,一侧子宫用4%多聚甲醛固定3天后用于苏木精-伊红(HE)染色、Msson染色和免疫组织化学染色;另一侧子宫经液氮冷冻后放入-80℃冰箱保存供实时荧光定量PCR实验,检测大鼠子宫内膜组织中Shh、Smo、Ptch1、Gli1的 mRNA表达水平。取材完成后大鼠断颈处死。

1.3 HE染色

取4%多聚甲醛固定的两组大鼠子宫中段组织石蜡包埋,5μm连续切片,切片常规脱蜡、水化,苏木素染液中浸染5 min后用清水去多余染液,用1%盐酸酒精将组织切片分化30s,流水冲洗返蓝,放入伊红染液中浸染20～30s,清水洗去多余伊红染液,将组织切片常规梯度脱水、透明,最后用中性树胶封片。

1.4 免疫组织化学染色

取4%多聚甲醛固定的两组大鼠子宫中段组织石蜡包埋、组织切片后经常规脱蜡至水后放入柠檬酸缓冲液(p H 6.0)中,加热至95～98℃、20 min进行抗原修复。取出切片冷却至室温,蒸馏水浸洗5 min后捞出切片,滴加3%H2O2后放入湿盒内室温孵育10 min,磷酸缓冲液(PBS)浸洗3次放入湿盒中,表面滴加5% 山羊血清,在37℃封闭30 min。弃去非免疫源性山羊血清,将稀释好的一抗(稀释倍数分别为:Smo 1:400、Shh 1:600、Ptch1 1:400、Gli1 1:500)滴加于组织切片上后放置于湿盒内,4℃过夜。次日取出切片PBS浸洗5 min 3次。将二抗滴加于织切片上放入湿盒中37℃孵育30 min后用PBS浸洗5 min 3次,最后进行DAB显色。经过充分水洗后将组织切片放入苏木精染色液中浸泡2 min,洗去残留的染色液后1%盐酸酒精分化2～3s后,1%氨水返蓝3～4s,梯度酒精脱水,经二甲苯透明后用中性树胶封片。Smo、Ptch1及Gli1抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司,Shh抗体购自博士德生物工程有限公司。

1.5 Masson染色

取4%多聚甲醛固定好的两组大鼠子宫中段组织石蜡包埋、组织切片后常规脱蜡至水,用Weigert铁苏木素染色液染色5～10 min,酸性乙醇分化液分化5～15s,水洗后Masson蓝化液返蓝3～5 min,蒸馏水洗1 min;丽春红品红染色液染色5～10 min,用弱酸工作液洗1 min,磷钼酸溶液洗1～2 min后再用弱酸工作液洗1 min;放入苯胺蓝染色液中染色1～2 min后弱酸工作液洗1 min,95%乙醇快速脱水,无水乙醇脱水3次,每次5～10s,最后用二甲苯透明3次,每次1～2 min,中性树胶封片。

1.6 实时荧光定量PCR反应

提取总RNA测定浓度后反转录成c DNA并作为模板,加入相应上下游引物及SYBR Pre mix Ex TaqTMII进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20μL,反应条件:95℃孵育30s,95℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环。以GAPDH为参照,每个样品每种引物重复3个孔,基因表达的相对变化采用2-△△Ct方法处理分析。序列见表1。

表1 各蛋白引物序列

1.7 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料以¯x±s表示,统计方法采用独立样本的t检验和单因素方差分析,以p＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 HE染色及Masson染色

HE染色结果,子宫内膜机械损伤后24h,大鼠子宫内膜结构破坏,子宫内膜上皮缺失,腺体减少;72h大鼠子宫腔结构未完全恢复,子宫腔被薄层内膜上皮覆盖;7d大鼠子宫内膜较72h稍增厚,腺体明显减少,子宫腔形态差,子宫内膜仍较正常内膜薄。Masson染色结果,子宫内膜机械性损伤后7d的大鼠子宫内膜蓝染程度明显较正常组增强,胶原纤维明显增加(图1、图2)。

2.2 免疫组织化学染色

显微镜下显示Shh、Smo、Ptch1及Gli1染色呈棕黄色颗粒,主要位于子宫腺体及内膜组织。Shh在正常组及子宫机械损伤后各时间点均未表达;Smo在正常组有表达,但在实验组24h表达很弱,72h后表达逐渐增强;Ptch1在正常组及实验组24h均有弱表达,72h后表达量明显上升;Gli1在正常组与实验组24h表达无差异,72h及7d表达量明显增加。(图3)。

图1 正常组和实验组大鼠子宫内膜HE染色(×100)

图2 正常组和实验组7d大鼠子宫内膜Masson染色(×100)

图3 正常组及实验组大鼠子宫内膜Shh,Smo,Ptch1及Gli1免疫组化染色(×100)

2.3 实时定量PCR检测

Shh mRNA在两组均未见表达。Smo mRNA在实验组24h的表达量是正常组的0.7倍,72h的表达量是正常组的1.4倍,7d的表达量是正常组的1.5倍(均p＜0.05);Ptch1 mRNA在实验组24h的表达量是正常组的1.2倍(P＞0.05),72h的表达量是正常组的3.3倍(p＜0.01),7d的表达量是正常组的2.5倍(p＜0.05);Gli1 mRNA在实验组24h的表达量是正常组的1.6倍(p＜0.05),72h的表达量是正常组的9.3倍(p＜0.01),7d的表达量是正常组的5.7倍(p＜0.01)。实验组72h Ptch1和Gli1的mRNA的表达量均高于24h的表达量,且72h Gli1的mRNA表达量高于7d的表达量(p＜0.01)。见图4。

图4 两组大鼠子宫Ptch1、Gli1、Shh、Smo mRNA表达水平

3 讨论

子宫内膜基底层损伤是导致宫腔粘连的主要原因,易发生于妊娠期的宫腔手术治疗后[10]。宫腔粘连可导致不孕、复发性流产、月经异常及腹痛等症状[11]。因此,预防和治疗子宫内膜损伤后导致的纤维化就显得尤为重要,但目前子宫内膜纤维化机制尚不清楚,本文对Hh信号通路与子宫内膜损伤后的纤维化之间的关系进行了初步探索。

Hh途径是动物体内存在的重要信号途径,参与胚胎发育、毛发周期和多种肿瘤的发生[12-15]。主要由Hedgehog配体(hh)、2个膜受体Ptch、Smo及下游的转录因子 Gli组成[16]。在脊椎动物中,Hh有3个同源基因Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)、Desert hedgehog(Dhh),这3个基因可编码相应的分泌蛋白—Hh配体。Smo和Gli1是HH途径的2个重要分子;Smo蛋白是信息转换器,它能够将细胞外的SHH信号转换成细胞内的Gli1信号。Hh信号通路途径在正常情况下,Ptch抑制Smo蛋白活性,从而抑制下游通路,这时Hh信号处于抑制状态。当Ptch与Hh结合后,解除了Ptch对Smo的抑制作用,Smo将信号传递给由驱动蛋白Cos2和Fu组成的蛋白复合体,使Gli家族成员中的稳定转录因子(Ci)转移至核内,激活下游靶基因转录[17]。

有研究表明,Hh信号通路参与多个组织器官损伤后的纤维化修复过程[17]。在成人肝脏损伤后重建时H H信号通路可以被激活,修复过程中Shh和Ihh表达明显增加[18-19]。其激活的机制可能是肝损伤后各种生长因子诱导肝细胞、肝星状细胞(HSC)表达Shh和Ihh或者肝脏上皮细胞通过旁分泌机制激活临近基质细胞的Hh信号[20-21]。Pritchett等[22]研究发现,当给予肝纤维化的小鼠模型使用Smo阻断剂时,Gli1、Gli2、Gli3表达量均下降,标志肝纤维化程度的Ⅰ型胶原蛋白也下降。Fabian等[23]发现在慢性肾纤维化患者肾小管细胞中Shh、Ihh、Gli1、Gli2的表达量均增加。在小鼠肾纤维化模型中使用Hh拮抗剂阻断此信号途径时,上述分子表达量降低,同时小鼠肾脏纤维化程度降低,表明Hh信号通路在肾纤维化过程中有重要作用。

Gli1既是Hh信号通路的靶标基因又是信号通路的转录因子,其表达水平反应了Hh信号通路的活性,也可反应出组织器官纤维化的程度。Kramann等[24]研究发现,当给予小鼠Gli阻滞剂Darinaparsin时,Gli1、Gli2、FN、Col-1、α-SMA的表达均降低,同时肾纤维化程度也明显降低。上述研究说明Gli信号通路在肾脏纤维化过程中起重要作用。本研究结果显示,实验组第7天的大鼠子宫内膜纤维化较正常组明显增加。且随着大鼠子宫内膜纤维化程度增加,实验组72h Smo的mRNA表达量开始上升,而Gli1和Ptch1的mRNA则显著上升。Ptch1、Gli1和Smo在子宫内膜损伤后mRNA表达量的变化趋势与子宫内膜的纤维化之间存在相关性。本研究也显示Shh在正常组及子宫机械损伤后每个时间点的大鼠子宫内膜及腺体上均未见表达,但Ptch1、Gli1和Smo的mRNA表达量都有不同程度上升,以Gli1上升最为显著,说明Hh信号通路可能参与了大鼠子宫内膜损伤后的纤维化修复,但Shh基因未参与,而参与的可能是Shh的同源基因。同时除经典Hh信号通路外,还存在其他的活化途径,如转化生长因子、成纤维细胞生长因子等在没有活化Smo的情况下使GLI转录从而调节下游靶基因的表达[25]。Moshai等[26]研究表明,从Smo水平抑制Hh通路,对纤维化无影响,从Gli水平抑制纤维化效果显著。此现象可能是由于Gli通过其他信号通路被活化所致,如FGF、EGF和MAPK通路。因此,Gli可能与多种纤维化相关信号通路有关,抑制Gli的活性可能成为组织器官纤维化治疗的靶标[27]。本次研究也显示子宫内膜损伤后Gli1上升显著而Shh几乎不表达,说明子宫内膜损伤后的纤维化修复与Gli1的关系密切,大鼠子宫损伤后的纤维化修复过程中Gli1可能是通过非经典Hh信号途径发挥作用。

总之,本研究表明Ptch1、Gli1和Smo在损伤后大鼠子宫内膜的表达变化与子宫内膜损伤后纤维化修复过程相关。Hh通路参与了子宫内膜损伤后的纤维化形成过程,但可能是通过Shh的同源基因或非经典途径参与子宫内膜纤维化修复,为进一步阐明子宫内膜损伤后的纤维化修复机制提供新视角。