牛肉中沙门氏菌热失活模型的建立

朱立贤,郑 婷,董鹏程,张一敏,毛衍伟,梁荣蓉,马文健,罗 欣,*

(1.山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安 271018; 2.威海海洋职业学院,山东威海 264300; 3.阳信县畜牧兽医局,山东阳信 251800)

沙门氏菌作为一种重要食源性致病菌,其引发疾病的特征性临床症状主要有急性胃肠炎、败血症和伤寒、副伤寒等[1]。由于沙门氏菌对人类的危害严重且分布广泛,因此世界各国常通过检测沙门氏菌是否存在,作为食品卫生与否的一个重要的指标[2]。美国每年有140万人通过食物源感染沙门氏菌[3]。在中国,40%～60%的食源性疾病是由沙门氏菌引起的[4]。在各类食品中,动物性食品如牛肉、猪肉、蛋、乳类等是引起沙门氏菌病暴发的主要媒介[5-6]。我国牛肉中沙门氏菌的检出率为3%～6%[7-9]。

沙门氏菌是主要的食源性致病菌之一,极易通过粪便、皮毛及交叉污染散播到肉牛屠宰和加工环境中,进而对分割牛肉造成一定的污染。采取有效的杀菌方法对预防沙门氏菌病具有重要作用。食品的杀菌方法有很多种,如热杀菌、非热杀菌(超高压、微波、辐射、高压脉冲电场杀菌)、添加各种防腐剂或抑菌剂等,而实现非热杀菌在实际生产中广泛应用还有一段距离,对食品工业和消费者来说热处理杀菌仍是最有效、最简便、使用最广泛的杀菌方法[10-11]。在很多情况下,细菌的热失活曲线并不遵循对数线性关系,在拟合细菌热失活曲线时经常出现非线性的现象[12]。近年来,Weibull模型被广泛的应用于食品微生物失活模型的拟合[13-14]。Chun等[15]研究了辐照对即食火腿中沙门氏菌失活模型的影响,Weibull模型很好地拟合了失活曲线。Chen[16]对牛奶中沙门氏菌的压力失活模型进行了评价,Weibull方程和Logistic方程的拟合性好于线性方程。韩洪玲等[17]研究表明,Weibull 模型可用来拟合金黄色葡萄球菌对超高压失活的抗性曲线,拟合效果优于Gompertz模型和线性模型。

国内有关致病菌预测模型的研究大多采用的是单一血清型菌种的人工污染[17-18],不同血清型沙门氏菌的耐热性不同[19]。美国农业部食品安全检验局建议使用不同血清型的混合菌株进行模拟接种试验,国外在建立沙门氏菌预测模型时大多是通过接种不同血清型的混合菌株进行研究[20-21]。因此，本研究选取了4个不同血清型沙门氏菌的混合菌株(3株分离自牛肉,1株ATCC菌株)进行热失活研究,以便更好地模拟沙门氏菌的实际污染情况。本文研究了不同温度热处理对牛肉中沙门氏菌的影响,用Weibull模型拟合牛肉中沙门氏菌的非线性失活曲线,建立了牛肉中沙门氏菌的热失活模型,为牛肉中沙门氏菌的控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

TSB(胰蛋白胨大豆肉汤) 北京陆桥技术有限责任公司;Hektoen Enteric Agar HE培养基 北京陆桥技术有限责任公司;Bag Filter-400 拍打袋 法国 Interscience公司;4株不同血清型的沙门氏菌混合菌株分别是肠炎沙门氏菌(Salmonella.Enteritidis)、德尔卑沙门氏菌(Salmonella.Derby)、阿贡纳沙门氏菌(Salmonella.Agona)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella.TyphimuriumATCC 14028),前三株均为山东农业大学动物性食品研究室董鹏程博士保存的牛肉源沙门氏菌菌株;牛肉样品是从山东某肉牛屠宰公司取的背最长肌,放入带冰的泡沫箱中3 h内运回实验室备用。

Bag Mixer-400W均质器 法国Interscience公司;Healsafe1200生物安全柜 法国力申科学仪器有限公司;CS504高级恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司;Gilson P200移液器 济南庄盟生物技术有限公司;HP-9272恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;DZ-300/2S小型程控全自动真空封装机 金桥科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的准备 无菌操作取背最长肌,在紫外灯下照射30 min后去除外周,无菌条件下将其切成1 mm厚的薄片,以每份(5.00±0.05) g进行真空密封,然后保存于-20 ℃备用,使用前置于0～4 ℃无菌条件下解冻,解冻后至实验之前,样品一直置于0～4 ℃条件下。

1.2.2 菌悬液的制备 无菌条件下,将4株不同血清型的沙门氏菌分别平板划线后挑取单菌落,分别接入TSB液体培养基中,37 ℃培养24 h,得到生长至稳定期的菌悬液(经预实验反复试验后的结果,4种菌株一样的培养条件),4株菌制得的菌悬液浓度约为108CFU/mL,将其1∶1∶1∶1混合,得到混合菌株菌悬液。

1.2.3 接种及真空密封 参考冯晓慧等[22]的方法,无菌操作取样品(5.00±0.05) g于菌悬液中浸蘸15 min(不断搅拌),于无菌铁网上晾2 h,然后装于拍打袋中,用0.1 MPa的真空度抽真空,使密封的样本充满整个袋子并使其厚度小于1 mm,以确保传热的统一。同时,按同样的操作将未经接种沙门氏菌菌液的肉样浸蘸于无菌蛋白胨水中作为空白对照。

1.2.4 热处理 将接种后的样品分别置于55、57.5、60、62.5和65 ℃温度条件的恒温循环水浴锅中进行热处理[23]。加热时间从1.5～35 min不等(加热时间的确定是综合考虑预实验试验结果和加热温度而定),热处理温度、时间与取样频率见表1。加热时,将样品快速地浸入热水中,按设计的时间间隔定时取出部分样品进行测定。将热处理后的样品取出立即放入冰水中阻止失活过程的继续。每一组温度时间的组合重复3次。

表1 热处理的温度、时间及时间间隔Table 1 Temperature,time and time intervals of thermal treatments

1.2.5 沙门氏菌计数 参考Yadav等[24]的方法,略有改动,取出冷却过的经热处理的肉样,表面用75%乙醇消毒,无菌条件下剪开,加入45 mL的0.1%无菌蛋白胨水,用均质器以最大速度(8次挤压/秒)拍打2 min,然后进行梯度稀释,取3个适宜浓度的稀释液涂布在HE选择性培养基上。涂布完成后,先将平板置于室温下约2 h,以使热受伤的细胞复苏,然后于37 ℃培养箱中培养48 h后计数,算出平均值并转换成lg(CFU/g)。

1.2.6 模型的建立和验证

1.2.6.1 沙门氏菌一级热失活模型的建立 分别将牛肉中沙门氏菌在55、57.5、60、62.5和65 ℃热处理条件下得到的试验数据进行拟合,用Weibull模型描述不同温度条件下的残存菌量与时间的关系。Weibull模型是将失活曲线看作细菌失活致死积累分布形式,这种累积形式可以用以下公式[25]来表示:

lg(Nt/N0)=-btn

式(1)

式中,N0为热处理前样品中沙门氏菌菌落数(CFU/g),Nt为热处理后样品中沙门氏菌菌落数(CFU/g),b为模型的规模参数(scale parameter),n为曲线形状参数(shape parameter)。

1.2.6.2 热处理温度对失活模型参数影响的二级模型的建立 利用线性回归的方法对沙门氏菌热失活参数b的自然对数值与温度(55～65 ℃)(式(2))进行拟合,得到牛肉中沙门氏菌失活的二级模型。

lnb=aT-c

式(2)

式中b是Weibull模型中的参数,a、c是常量系数,T是温度。

1.2.6.3 沙门氏菌的热失活模型的验证 本研究采用的是外部验证[26],在55～65 ℃间随机选58.5 ℃和65 ℃的热失活数据对模型进行验证。应用建立的沙门氏菌热失活动力学模型求得58.5 ℃和64 ℃下的预测值,与在58.5 ℃和64 ℃热处理实验中的沙门氏菌的实际检测值进行比较,采用准确度Af、偏差度Bf、和均方根误差(RMSE)来评价所建模型的可靠性[27],准确因子、偏差因子和均方根误差的表达式如下:

Af=10(∑|Npre-Nobs|)/n

Bf=10(∑(Npre-Nobs))/n

式中,Nobs是实际测得的沙门氏菌数量的对数值,Npre是应用沙门氏菌热失活模型得到的与Nobs同一时间的微生物数量的对数值,n是试验次数。

1.3 数据处理

试验数据采用SAS 9.0 统计软件对选取的Weibull模型进行拟合建立一级模型,通过线性回归建立温度对一级模型参数影响的二级模型。

2 结果与分析

2.1 不同热处理条件下沙门氏菌的一级热失活模型的建立

目前,建立致病微生物预测模型的培养基质一般分为两种,一是基于液体培养基,此方法简单、快速,比在真实食品上更容易控制不同的影响因子[28]。大部分已建立的模型都是在液体培养基上建立的,例如美国农业部开发的致病菌预测程序(PMP),英国的农、渔、食品部(UKMAFF)与英国食品研究所(IFR)联合开发的食品微模型都是基于此[29],但缺点是没有考虑到原料组织(脂肪含量,pH和水分活度)对微生物的实际影响,因此预测结果往往偏高[30-31]。二是以真实食品(肉类、果蔬制品、蛋类和乳类等)为基质来获得微生物的生长或失活数据从而建立预测模型,虽然方法繁琐,测定数值的精度低于液体培养基,但能充分考虑食品原料组织对微生物的实际影响作用,真实性高,所建动力学模型能有效预测微生物在实际食品上的情况[32]。因此,本研究将沙门氏菌接种到牛肉表面建立沙门氏菌的热失活模型。

采用Weibull模型拟合牛肉中沙门氏菌的热失活曲线见图1,相关参数见表2。Weibull模型拟合的热失活曲线的p值均小于0.01,判定系数R2分别为0.993(55 ℃)、0.984(57.5 ℃)、0.999(60 ℃)、0.999(62.5 ℃)和0.998(65 ℃),即在0.984～0.999之间,说明Weibull模型能很好地拟合牛肉中沙门氏菌的热失活曲线。参数b是模型的尺度参数,反映对细菌致死效果的优劣,b值越大,说明细菌活菌的瞬时降低速度越快,抵抗不利环境的能力就越差,b受热处理温度的影响[33]。在微生物的失活/致死动力学的研究中,常因细菌含有亚菌群,导致存活曲线呈非线性,当用微生物残存菌量或菌数减少量-时间曲线来表达不同致死因子杀灭微生物的作用效果时,一般会出现S形、凸形、凹形等曲线形式[33]。参数n是形状参数,一方面直观反映失活曲线的形状,另一方面n值的大小代表特定意义。n>1,曲线呈凸面,表明失活模型的曲线随时间的增加呈加快的趋势,即时间越长,微生物越易死亡,热处理对细菌有累计杀灭作用[34];n值越接近于1,说明Weibull曲线越接近线形。当n<1时,模型呈现凹状的存活曲线,n越小,存活曲线的下降趋势减慢,说明菌株的残存菌量较高[35]。一般同一种处理对同种微生物的影响相似,n值变化不显著,为了模型的简化,可将n值视为定值[33,36],本实验中n值平均值为0.59,曲线呈凹形,说明随着加热时间延长对沙门氏菌产生了拖尾效应,这与Mattick等[37]报道的培养基中沙门氏菌的热失活曲线和Phungamngoen等[38]研究的沙门氏菌耐热性的结果一致。类似的研究Li等[39]用Weibull模型拟合了花生酱中沙门氏菌热失活曲线也呈下凹现象。

图1 Weibull模型在55、57.5、60、62.5和65 ℃条件下拟合牛肉中沙门氏菌的热失活曲线Fig.1 Thermal inactivation curve of Salmonella in beef under 55,57.5,60,62.5 and 65 ℃ applying Weibull model

表2 沙门氏菌热失活模型的参数Table 2 Parameter values of the thermal inactivation model for Salmonella in beef

2.2 沙门氏菌二级失活模型的建立

由以上分析可知,应用Weibull最适失活模型均能拟合不同温度下沙门氏菌的热致死情况,但却无法描述不同加热温度的变化对沙门氏菌热失活的影响,因此需要建立一个关于温度对一级模型参数b影响的二级模型。由图2可以看出,Weibull模型一级模型参数b受温度的影响,随着加热温度的升高,参数b不断呈指数增大,其拟合方程为lnb=0.47T-28.07,相关系数R2为0.909,说明该模型描述的温度与一级模型参数b之间的关系是可信的。

图2 温度对Weibull模型参数b的影响Fig.2 Effect of temperature on the parameter b of the Weibull model

2.3 热失活动力学模型的验证

为了全面评价所建模型的可靠性,Ross[27]提出了准确度和偏差度的概念,准确度Af衡量预测值和实验值之间的差异,偏差度Bf表示预测值上下波动的幅度。本试验用在58.5和64 ℃条件下沙门氏菌存活的观察值与应用预测模型计算得到的沙门氏菌存活的预测值来计算准确度Af偏差度Bf和RMSE,以综合评价和验证模型的可靠性。

由表3可以看出,Af为1.071和1.056,说明预测值和实测值之间的差异是在10%以内;Bf为0.998和1.002,说明预测值上下波动的幅度小于10%;RMSE值均小于0.12,误差较小,进一步说明本研究建立的模型能很好地预测不同温度处理对沙门氏菌的影响。

表3 58.5 ℃和64 ℃热处理牛肉中沙门氏菌失活预测值的 准确度(Af),偏差度(Bf)和RMSETable 3 Accuracy factor,bias factor and RMSE of Salmonella in beef at 58.5 and 64 ℃

3 结论

该文应用Weibull模型拟合了不同热处理条件下牛肉中沙门氏菌的失活曲线,相关系数(R2)在0.984～0.999之间,说明Weibull模型能很好地拟合牛肉中沙门氏菌的热失活情况;建立了温度对Weibull模型参数b影响的二级模型,即lnb=0.47T-28.07,相关系数(R2)为0.909。用58.5和64 ℃下实际的沙门氏菌存活数对所建的模型进行验证,准确度(Af)和偏差度(Bf)均在可接受范围内,表明该模型能很好地预测牛肉中沙门氏菌在58.5和64 ℃下的失活动态。本文得到的牛肉中沙门氏菌失活模型可以快速可靠的预测沙门氏菌在55～65 ℃之间的热失活情况,可以作为热处理杀灭牛肉中沙门氏菌的理论参考。