富氢盐水拮抗顺铂对小鼠耳毒性的作用研究

卢燕 林信衡 蔡友铮 徐浩 王宏波 吴小波 林昶 钟秀荣 孙丽清

1福建医科大学附属福州市第一医院耳鼻咽喉头颈外科（福州350009）

2福建医科大学附属协和医院耳鼻咽喉头颈外科（福州350001）

3青岛泛润经贸有限公司（青岛266107）4福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科（福州350005）5福建医科大学公共技术中心电镜室（福州350122）

顺铂作为一种高效抗癌药，被广泛用于治疗多种恶性肿瘤[1]。然而该药具有严重的耳毒性、肝肾毒性及骨髓抑制等，成为影响其临床应用乃至停药终止化疗的重要因素。Previati等[2]研究结果示在分子水平顺铂的耳毒性和肾毒性与活性氧的产生有关，可导致细胞活性氧的大量基因转录，产生大量的活性氧。耳蜗内活性氧的增加可进一步引起脂质过氧化反应、毛细胞内钙超载，导致毛细胞凋亡，使用者可出现高达93%的感音神经性聋[1]和耳鸣，严重影响患者的生活质量。因此，防治顺铂引起的耳毒性尤为重要。近年来，氢分子学的大量研究，提示富氢盐水、饱和氢生理盐水[3-7]具有渗透快、无毒副作用、价格便宜，可有效通过血-迷路屏障清除噪声引起的耳蜗毛细胞内大量氧自由基，发挥选择抗氧化作用，减少毛细胞的凋亡。本研究通过腹腔注射顺铂，建立小鼠耳毒性模型，从听力学及形态学两方面验证富氢盐水能否通过清除耳蜗毛细胞内的氧自由基，拮抗顺铂引起的耳毒性，从而对化疗过程中顺铂引起的耳蜗损伤起到一定的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

体重25-30g健康、听性脑干诱发反应（ABR）阈值正常的C57小鼠30只。雌雄不限，由福建医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号2015000500962。

1.2 实验试剂

富氢盐水（青岛泛润经贸有限公司提供），顺铂（江苏豪森药业集团有限公司提供，批号170305），0.9%生理盐水（福州海王福药制药有限公司提供批号 150807002）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

随机分成3组，对照组（单纯腹腔注射生理盐水组）10只；顺铂组（单纯腹腔注射顺铂）10只；富氢盐水组（腹腔注射顺铂+富氢盐水）10只。

1.3.2 动物造模

对照组及顺铂组，每天分别腹腔注射0.9%生理盐水和顺铂4mg/kg，连续注射7天；富氢盐水组，每天腹腔注射顺铂4mg/kg后立即再腹腔注射新鲜配置的富氢盐水1ml/100g，连续注射7天。

1.3.3 听力学检测

腹腔注射上述液体7天后立即行听性脑干诱发反应（ABR）检测。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.4ml/kg）。使用丹麦ICS ABR仪，参考电极插入测试耳耳垂，地极插入对侧耳耳垂，记录电极插入颅顶正中，在听力室内以短声（Click）作为刺激声，以能分辨出可重复的ABR波III的最低刺激强度判断阈值。

1.3.4 扫描电镜标本制备

第7天听力检测完后，立即断头，取出双耳听泡，快速分离耳蜗，将耳蜗浸在2.5%戊二醛固定液中，在解剖显微镜下用1ml注射器针尖在蜗尖打孔，挑破圆窗膜，用镊子取出镫骨。用带有橡胶头的微细玻璃管吸取2.5%戊二醛固定液从蜗尖小孔灌注耳蜗5次，使固定液从蜗尖流向蜗底，经前庭阶、鼓阶从卵圆窗和圆窗流出。将耳蜗放在含有该固定液的5mlEP管中4°C冰箱固定4小时。用10%EDTA脱钙7天(每天换液）。1%四氧化锇后固定2小时。用0.1mol/L的磷酸缓冲液（PBS）充分漂洗耳蜗后，在解剖显微镜下用镊子去除耳蜗骨壳、螺旋韧带及前庭膜，尽可能的去掉盖膜，充分暴露螺旋器。将解剖好的标本放进2%单宁酸溶液中导电染色1小时，然后行梯度乙醇脱水（50%、70%、90%、100%）2次，每次每级浓度脱水30分钟。醋酸异戊酯置换乙醇，用EMITECH K850临界点干燥仪干燥标本，Quorum Q150R ES真空离子溅射仪进行镀膜后，装于有干燥剂的玻璃干燥器内密闭保存。用SU8000高分辨扫描电镜观察并拍摄照片。

1.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS18.0统计软件分析，数据以表示，ABR阈值自身给药前后选用配对样本t检验，三组间两两比较采用单因素ANOVA分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 听力学结果

2.1.1 ABR测试结果

给药前，各组本底ABR阈值均正常，三组间无统计学差异（P=0.902）。给药后顺铂组、富氢盐水组ABR阈值均明显高于给药前，有差异统计学意义（P＜0.001），对照组给药前后比较无差异（P=0.077），无统计学意义。对照组、富氢盐水组ABR阈值均明显低于顺铂组，有统计学意义（P＜0.001）；富氢盐水组给药后ABR阈值明显高于对照组，，有统计学意义（P＜0.001）。提示富氢盐水有拮抗顺铂对小鼠耳毒性的作用，可减轻顺铂引起的听功能损伤，起到了一定的保护作用。见表1，图1。P＜0.001before administration v.s.after administration;***P＜0.001 among groups before or after administration.

图1 给药前后各组小鼠ABR阈值变化比较给药前，各组本底ABR阈值正常，三组间无统计学差异（P＞0.05）;给药后，三组间均有统计学差异，###P＜0.001,各组用药前后之间比较；***P＜0.001，用药前后组间比较。Fig.1 ABR thresholds changes before and after administration Before administration,there were no significant differences among groups(P＞0.05).After administration,the ABR thresholds of cisplatin group and hydrogen-rich saline group were significantly increased compared with control group.However,the ABR thresholds of hydrogen-rich saline group were significantly lower than those of cisplatin group.###

2.1.2 扫描电镜观察结果

扫描电镜下可见对照组耳蜗内、外毛细胞及静纤毛结构完整，静纤毛无明显缺失、散乱、倒伏。顺铂组动物耳蜗基底膜第一圈内毛细胞静纤毛广泛性缺失，剩余静纤毛散乱、倒伏；外毛细胞散在缺失；第一、二排外毛细胞静纤毛个别缺失、倒伏；第三排外毛细胞静纤毛广泛性缺失，剩余静纤毛排列散乱、倒伏，表皮板塌陷破裂。第二圈内毛细胞静纤毛散在缺失、倒伏；外毛细胞静纤毛未见明显缺失、倒伏和融合，表皮板塌陷破裂。富氢盐水组动物耳蜗第一圈内毛细胞静纤毛散在缺失，排列稍散乱，无倒伏；外毛细胞静纤毛仅见个别自然缺失，个别静纤毛轻度融合，表皮板轻度破裂。第二圈内、外毛细胞静纤毛未见明显缺失、散乱、倒伏和融合，仅见表皮板破裂。（见图2）

图2 A、B分别为对照组耳蜗第一、二圈，耳蜗内、外毛细胞及静纤毛结构完整，静纤毛无明显缺失、散乱、倒伏。C、D图为顺铂组耳蜗第一、二圈，C图可见内毛细胞静纤毛广泛性缺失、倒伏，外毛细胞静纤毛部分缺失，剩余静纤毛散乱、倒伏，表皮板塌陷破裂；D图可见内毛细胞静纤毛散在缺失、倒伏；外毛细胞静纤毛未见明显缺失、倒伏和融合，表皮板塌陷破裂。E、F分别为富氢盐水组耳蜗第一、二圈，内毛细胞静纤毛散在缺失，排列稍散乱，无倒伏，外毛细胞静纤毛仅见个别自然缺失，个别静纤毛轻度融合，表皮板轻度破裂；第二圈内、外毛细胞静纤毛未见明显缺失、散乱、倒伏和融合，仅见表皮板破裂。Fig.2 A and B The first and second turns of cochlea in the control group.The hair cells（including inner and outer hair cells）and stereocilia structure were intact with no obvious lack,scattered,and lodging of stereocilia;C and D The first and second turns of cochlea in the cisplatin group.There were widespread lack of stereocilia in the inner hair cells and the loss of the stereocilia in the outer hair cells.The remaining stereocilia were scattered and collapsed,and the cuticular plate collapsed and ruptured.D The stereocilia of the inner hair cells were absent and inverted,while there was no obvious loss,collapse or fusion of the stereocilia in the outer hair cells,and the cuticular plate collapsed and ruptured.E and F The first and second turns of cochlea in the hydrogen-rich saline group,respectively.The stereocilia of inner hair cells were absent，the arrangement was slightly scattered,with no collapse.A few stereocilias of outer hair cells were absent or fused,with slightly cuticular plates broken.In the second turn,there was no obvious loss,disorder,collapse or fusion in the stereocilia of the outer hair cells,only the cuticular plate was broken.

表 1 ABR 阈值（±s，n=20）（dB nHL）Table 1 ABR Threshold（±s，n=20）（dB nHL）

表 1 ABR 阈值（±s，n=20）（dB nHL）Table 1 ABR Threshold（±s，n=20）（dB nHL）

Group Control group Cisplatin group Hydrogen-rich saline group Ear 20 20 20 ABR thresholds Before administration 16.50±0.86 16.75±0.06 17.00±0.40 After administration 18.50±4.01 56.00±0.95 28.75±5.82

3 讨论

顺铂的致聋机制目前尚不完全清楚，主要包括自由基机制、凋亡机制、血管纹功能障碍等机制。大量研究显示顺铂的耳毒性与产生过量的活性氧自由基及降低耳蜗组织中的抗氧化酶类活性有关[8-10]。正常情况下，耳蜗具有自己的活性氧清除系统，主要以超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的形式存在于Corti器及血管纹[11]，维持着正常的活性氧动态平衡。只有当活性氧的生产增加或清除系统功能下降时，活性氧蓄积才会引起耳蜗组织的氧化损伤。已知给予适当的抗氧化剂药物能够减轻顺铂引起的内耳损伤[9]，如硫普罗宁、白藜芦醇、维生素E、褪黑素、n-乙酰半胱氨酸、水杨酸钠、大蒜素等均可降低顺铂的耳毒性。然而，其中大部分药物同时被发现可协同减弱顺铂的抗肿瘤作用[12]。而杨庆玺[13]研究证明应用富氢水对恶性肿瘤化疗病人有明显的减毒增效作用。因此，我们大胆推测在顺铂应用早期及时给予适当的富氢盐水，可以抑制耳蜗组织中氧自由基的产生，减少氧化损伤，改善耳蜗组织内的抗氧化防御体系，从而减轻顺铂的耳毒性。故本实验选择在腹腔注射顺铂后立即腹腔注射富氢盐水。本实验给药后，顺铂组的ABR阈值明显升高，富氢盐水组的ABR阈值也较给药前明显升高，但明显低于顺铂组，高于对照组，提示富氢盐水起到了一定的拮抗顺铂耳毒性的作用，对小鼠的听力起到了一定的保护作用。上述数据说明富氢盐水对顺铂引起的小鼠耳毒性也有一定的保护作用。

目前富氢盐水被广泛研究于各种动物模型，发现其对多种疾病具有保护作用，可显著改善心肌缺血再灌注损伤、小肠缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病的记忆功能等[13-16]。本研究通过扫描电镜观察发现，顺铂可引起耳蜗内外细胞的结构破坏与损伤，而且内毛细胞静纤毛缺失情况较外毛细胞重，第一圈损伤较第二圈损伤重。腹腔注射富氢盐水后可明显减轻耳蜗内外毛细胞静纤毛的损伤缺失。进一步也从形态学上验证了富氢盐水可有效减轻顺铂引起的耳蜗损伤，对顺铂致小鼠耳毒性起到一定程度的保护作用。其机理可能是富氢盐水通过快速渗透，进入血-迷路屏障，有效清除顺铂产生的大量氧自由基，发挥其选择性抗氧化作用，减少内外毛细胞的凋亡。但具体作用机制尚不明确。许多研究显示，细胞凋亡在顺铂的耳毒性作用中同样起着重要作用。欧洲学者研究发现，耳蜗毛细胞和前庭毛细胞的顺铂耳毒性培养基培养中发现了大量的肿瘤抑制基因—p53免疫组织化学阳性产物，据此推测顺铂有可能通过调控p53通路引起耳蜗组织内毛细胞的凋亡[17]。富氢盐水能否通过p53通路减轻顺铂引起的耳蜗毛细胞的凋亡尚不明确，在后续的研究中课题组将用Tunel检测来验证这一结果，为进一步阐述富氢盐水拮抗顺铂耳毒性的作用机理提供依据。

目前已有临床研究将富氢盐水通过口服的方式给予正在化疗的恶性肿瘤患者服用，富氢盐水对顺铂引起的骨髓抑制、肝肾毒性、心脏有显著的保护作用[12]。本实验因是动物实验，我们无法定时、定量控制小鼠对富氢盐水的饮用量，故采用了腹腔注射的方法，更容易方便、快捷的进行量化富氢盐水对顺铂的影响。在今后的临床应用中，我们可以采用口服的方法，像正常口服药物或者作为正常饮用水来饮用用于恶性肿瘤患者化疗前和化疗过程中，甚至化疗结束休息期，来预防和减轻顺铂引起的耳毒性，从而减少患者的听力损害，减少感音神经性聋及耳鸣的发生，提高生活质量。因此，富氢盐水对恶性肿瘤化疗患者带来了新的福音，具有巨大的临床应用前景和社会效益。

本研究通过听力学及形态学方面的研究，初步探讨了富氢盐水拮抗顺铂耳毒性的作用，为临床防治顺铂引起的听力损害提供新的实验依据，也为全面深入研究富氢盐水拮抗顺铂耳毒性的作用机制奠定了基础。本实验因尚处在研究初期，课题组将在后续的实验研究中进一步探讨腹腔注射顺铂后不同时间点腹腔注射富氢盐水，富氢盐水拮抗顺铂的耳毒性作用等问题，并进一步探讨富氢盐水拮抗顺铂耳毒性的分子机制、药代动力学，进一步明确最佳给药时间、给药浓度及给药频率、方式。