HPLC法测定防风炭中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量

焦 坤

(阜阳市食品药品检验检测中心，阜阳 236500)

防风为常用中药，在《神农本草经》中被列为上品，系伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根[1]，具有解表祛风、胜湿、止痉的功能，用于治疗感冒头痛、风湿痹痛、风疹瘙痒及破伤风等。防风炭为防风的加工炮制品，在临床上应用也较为广泛。防风炭常用于止血，多用于肠风便血、崩中漏下等治疗。常与大蓟、地榆、蒲黄、黄柏、白茅根、仙鹤草、三七和侧柏炭等配合使用。防风的化学成分主要有色原酮类[2-3]、香豆素类[4-5]、挥发油[6-9]和多糖类[10-11]等。目前，针对防风的质量控制研究[12-16]较多。根据前人的研究，防风中的色原酮是其发挥疗效的物质基础[17-19]。胡紫艳等[20]对不同产地的防风以5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚、苷升麻素和升麻素苷4种色原酮为指标进行了含量分析。邵留英等[21]对不同产地的防风中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量进行了对比分析。赵博等[22]用HPLC法同时测定了防风中6个主要成分的含量。《中国药典》2015 年版一部防风项下以升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷为质控指标，其炮制品种防风炭暂未收录。目前关于防风炭含量测定方面研究较少，如何做到“炒炭存性”，尚缺乏有效的质量控制指标。本文通过建立合理高效的HPLC法同时测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷，进一步加强对防风炭的质量控制，提高疗效。

1 仪器与试药

1.1仪器 Thermo UIti Mate 3 000 型高效液相色谱仪 (美国赛默飞世尔科技公司，包括 DAD3000 型检测器、变色龙 7.2 软件工作站)；XPE205DR 型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司) ； E100H 型超声清洗仪 (德国艾尔玛仪器公司)。

1.2试药 升麻素苷(prim-O-glucosylcimifugin)对照品(批号111522-201310，质量分数为95.0%)，5-O-甲基维斯阿米醇苷(5-O-methylvisammioside)对照品(批号111523-201509，质量分数为95.8%)，均购自中国食品药品检定研究院；10批不同产地的防风炭(安徽省万生中药饮片厂，编号分别为：FFC01，FFC02，FFC03，FFC04，FFC05，FFC06，FFC07，FFC08，FFC09和FFC10)。HPLC所用的甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。水为纯化水，自制。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Rigol-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶水(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；在此色谱条件下，样品中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的分离度大于1.5。理论塔板数按照升麻素苷峰计算应不低于4 000。结果见图1。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.供试品溶液；1.升麻素苷；2.5-O-甲基维斯阿米醇苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A．mixed reference substance；B.sample；1.prim-O-glucosylcimifugin；2.5-O-methylvisammioside.

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品储备液 分别精密称取升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.292 4和0.284 5 mg·mL-1的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品溶液，作为储备液。

2.2.2供试品溶液 取本品细粉0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3线性关系 精密吸取2.2.1项下制备的储备液各1.0，2.0，2.5，5.0和10.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，加储备液，得到6个不同系列质量浓度的对照品溶液。按照2.1项下的色谱条件进样分析，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y)，得到升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的标准曲线：(升麻素苷：y=119.706 4x+0.038 29，r=0.999 4；5-O-甲基维斯阿米醇苷：y=135.704 5x+0.083 54，r=0.999 4)。结果表明，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的进样量分别在0.011 6～0.292和0.011 4～0.285 mg·mL-1范围内，质量浓度与峰面积的线性关系良好。

2.4精密度实验 取2.3项下稀释得到的系列对照品溶液(2.5→25)，按照2.1项色谱条件下进行测定，连续进样5次，每次5 μL，记录峰面积。升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰面积的RSD值分别为1.309%和1.347%。结果表明，仪器精密度良好。

2.5重复性实验 取编号为FFC10的防风炭0.5 g，按照2.2.2项下的方法制备6份供试品溶液，然后按照2.1项色谱条件测定峰面积值，分别求得升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量分别为0.302%和0.190%，其RSD值分别为0.74%和1.95%。结果表明，该方法重复性良好。

2.6稳定性实验 精密吸取2.2.2项下的同一供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别在0，2，4，8，12和24 h进样分析，结果升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰面积的RSD值分别为1.11%和1.32%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.7加样回收率实验 取同一已知升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的供试品溶液6份，分别加入储备液各1.0 mL，按照2.1项下色谱条件进样分析，计算得到升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均回收率分别为93.14%和95.09%，结果表明，该方法的回收率良好。见表1。

表1加样回收率测定结果

Tab.1 Results of recovery test

化学成分实测值/mg样品含量/mg加入量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%升麻素苷0.546 00.280 80.292 490.7293.142.510.562 20.280 90.292 496.230.560 80.284 60.292 494.460.547 70.281 80.292 490.940.561 00.283 60.292 494.890.549 30.281 30.292 491.645-O-甲基维斯阿米醇苷0.549 20.282 80.284 593.6395.092.260.558 60.282 90.284 596.880.560 00.286 60.284 596.090.544 50.283 80.284 591.630.562 40.285 60.284 597.300.553 70.283 40.284 595.01

2.8样品测定 取10批不同产地的防风炭样品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定峰面积。根据标准曲线求得10批防风炭中升麻素苷的含量分别为0.180%，0.111%，0.211%，0.307%，0.160%，0.108%，0.167%，0.261%，0.273%和0.302%；5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量分别为0.082%，0.112%，0.364%，0.220%，0.208%，0.165%，0.099%，0.181%，0.179%和0.190%。结果表明，不同产地的防风炭所含的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷差异较大，可能与产地、采收时期和炒炭程度等因素有关，具体原因有待进一步研究。

3 讨论

3.1测定波长的选择 参照《中国药典》2015年版一部防风项下的方法，选取254 nm作为检测波长，发现升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇色谱峰信号强，峰形较好，符合测定要求。

3.2流动相的选择 本实验分别比较了甲醇-水，甲醇-磷酸-水和乙腈-甲醇-水[23]等系统，结果表明，甲醇-水作为流动相，基线较为平稳，且对色谱柱损伤小，最终采用甲醇-水作为本实验方法的流动相。

3.3提取溶剂的选择 本文比较了甲醇、乙醇和体积分数为50%的甲醇提取溶剂，结果显示，甲醇的提取率高于乙醇和体积分数为50%的甲醇。同时参考文献，发现甲醇对色原酮的提取率高[6]。因此，本实验选择甲醇作为提取溶剂。

3.4方法的适用性 本实验所建立的HPLC法测定防风炭中的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量方法，具有快速、准确、专属性强、重复性好等优点，可有效评价防风炭的质量，为含有防风炭的成方制剂的质量控制提供了参考。