育亨宾树皮中育亨宾提取工艺研究

张 敏，闫高颖，张必荣，王 平，任晓峰

(1.陕西天谷生物科技集团有限公司，西安 710065；2.汉中天然谷生物科技股份有限公司，汉中 723100)

育亨宾(yohimbine)是一种有兴奋作用的天然单萜吲哚类生物碱，其化学结构为17-α-羟基育亨宾-16-α-羧酸甲酯(methyl 17-α-hydorxy-yohimban-16-α-carboxylate)[1]，最早从西非茜草科育亨宾树(Corynantheyohi-mbeK.Schum)的干皮中提取[2]，树皮中总生物碱质量分数为6.1%，其中育亨宾碱占总生物碱的10%～15%[1]。在非洲育亨宾以树皮入药，可在一年中的任何时候采集，作为催欲药的使用历史悠久[2]。我国夹竹桃科植物萝芙木属(Rauvlfia)根中含有少量育亨宾，据报道，以云南景洪产的萝芙木中育亨宾含量较其他产区高[3-4]。现代药理研究表明，育亨宾作为一种有效的α2-肾上腺素受体拮抗剂[5]，在治疗男性性功能障碍方面作用显著，被认为是治疗阳痿的有效药物[6]，同时该活性物质具有扩张外周血管、降低血压[7-8]和消炎[9-12]等作用。目前对育亨宾的研究主要集中在检测方法[13-15]、药理学[16]和药效学[17-18]等方面，对育亨宾的提取工艺报道较少。雷智东等[19]以盐酸育亨宾为定量检测指标，通过正交实验考察了提取溶剂、料液比和提取时间3个因素对盐酸育亨宾提取率的影响；郭占京等[20]以广西产的萝芙木为原料，采用响应面优化超声波辅助提取法，以育亨宾提取量为响应值，选取粒度、提取液pH值、提取时间和料液比为自变量，考察育亨宾的工艺条件，该工艺下的参数对以育亨宾树皮为原料提取的有效物质含量和稳定性有待考察。本研究以育亨宾为含量检测指标，全面考察提取溶剂、料液比、提取时间和提取温度等因素对育亨宾提取率的影响，用正交实验设计，优化育亨宾最佳提取工艺，为育亨宾提取物的工业化生产提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 HH-S4型数显恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；BP25S 型电子天平(德国赛多利斯公司)；TQ-100型高速万能粉碎机(永康市天祺盛世工贸有限公司)；高效液相色谱(Thermo Ultimate 3000型四元泵、二极管阵列检测器、自动进样器)(赛默飞世尔科技有限公司)；Q型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Maxima超纯水机(美国基因公司)。

1.2试药 育亨宾树皮购自西安市万寿路药材市场经陕西中医药大学药学院生药教研室鉴定为非洲植物育亨宾树CorynanteYohimbeK.Schum的干燥树皮；育亨宾对照品(美国Sigma公司，批号BR-04484)；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1育亨宾的含量测定

2.1.1色谱条件及系统适用性实验 色谱柱：Thermo TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(5∶1，pH值为4.0)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，育亨宾对照品和样品色谱图见图1。结果表明，样品中的育亨宾与其他组分达到了基线分离，分离度大于2.0。

图1HPLC图

A.对照品；B.样品；C.阴性对照品；1.育亨宾。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative control;1.yohimbine.

2.1.2对照品溶液的制备 精密称取1 mg育亨宾对照品，用体积分数为90%的甲醇充分溶解并定容至1 mL量瓶中，摇匀，即得质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 称取干燥粉碎后的育亨宾树皮粗粉1.0 g，置于100 mL量瓶中，加入50 mL体积分数为 90%的甲醇溶解，超声提取30 min，冷却至室温，定容至100 mL，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷藏备用。

2.1.4阴性对照品溶液的制备 取空白样品，按照2.1.3项下方法制备。

2.1.5线性关系考察 吸取2.1.2项下制备的育亨宾对照品溶液适量，分别稀释成质量浓度为800，400，200，100，50和10 μg·mL-1的系列对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷藏备用。按照2.1.1项下色谱条件连续进样10 μL，分别重复3次，记录峰面积。以对照品质量浓度(x)对峰面积(y)进行回归分析，得回归方程y=2.232 7x-3.913 6(r=0.999 9)。育亨宾质量浓度在10～800 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.1.6精密度实验 精密吸取育亨宾对照品溶液10 μL，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，测定育亨宾峰面积的RSD值为0.8%，结果表明，精密度良好。

结合学生已经掌握的理论知识和实践技能，我们可以借助于“项目”任务，来强化学生对知识、技能的复合应用。旅游管理涵盖的现实问题较多，通过“项目”研究教学模式，以“多问题、多前提、多变量”为项目分析思路，将学生进行分组，鼓励各组学生合作、探究，解决问题。该模式需要强调：一是“项目”难度的把控，要适当；二是“项目”划分要体现小组合作研究，强调学生间的配合；三是突出“项目”完成成果形式，可以是研究报告、论文、对策建议等。

2.1.7稳定性实验 取2.1.3项下制备的供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，6，8，10和12 h进样，测定育亨宾的峰面积RSD值为0.9%，结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.8重复性实验 取5份2.1.3项下制备的供试品溶液5份进行测定，育亨宾峰面积的RSD值为2.5%，结果表明，样品重复性良好。

2.1.9回收率实验 精密称取5份已知含量的育亨宾树皮粗粉0.1 g，分别置于10 mL量瓶中，加入1 mg对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样，平均回收率为103.40%，RSD值为0.85%。

2.2样品测定 按照2.1.3项下方法制备供试品溶液；分别精密吸取对照品与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，连续平行测定3次，记录峰面积，按照标准曲线法计算育亨宾含量。结果育亨宾的含量分别为6.23%，6.19%和6.26%，平均含量为6.23%，RSD值为0.56%。

2.3单因素实验

2.3.1提取溶剂种类的确定 称取2 g育亨宾粗粉，4份，分别溶于10 mL质量浓度为1 g·L-1的酒石酸、质量浓度为1 g·L-1的柠檬酸、体积分数为0.1%的醋酸和质量分数0.1%的盐酸中，料液比为1∶22，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，计算育亨宾的收率，确定最佳提取溶剂，结果显示，以育亨宾的收率为指标成分，对4组提取溶剂进行考察，随着提取溶剂酸性的增强，育亨宾的收率呈上升趋势；当提取溶剂为质量分数0.1%的盐酸时，收率可达106.6%。故选择质量分数为0.1%的盐酸作为提取溶剂。

2.3.2提取溶剂质量分数的确定 称取2 g育亨宾粗粉5份，分别溶于10 mL质量分数分别为 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%的盐酸溶液中，料液比为1∶22，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，计算育亨宾的收率，确定最佳提取溶剂质量分数，结果显示，以育亨宾的收率为指标成分，对不同质量分数的盐酸进行考察，当盐酸的质量分数为0.2%时，收率可达最大值107.5%；而后随着提取溶剂质量分数的增大，育亨宾的收率呈下降趋势，推测强酸破坏了目标成分育亨宾的溶出，影响了育亨宾的提取效果，故选择提取溶剂为质量分数为0.2%的盐酸。

2.3.3料液比的确定 称取2 g育亨宾粗粉4份，溶于10 mL质量分数为0.2%的盐酸溶液中，分别在料液比为1∶20，1∶22，1∶26和1∶28的条件下，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，计算育亨宾收率，确定最佳料液比，结果显示，以育亨宾的收率为指标成分，对不同料液比进行考察，随着料液比的增加，育亨宾的收率呈上升趋势，但当料液比从1∶22上升到1∶28时，收率增加缓慢，综合考虑，选择料液比为1∶22。

2.3.4提取时间的确定 称取2 g育亨宾粗粉5份，分别溶于10 mL质量分数为0.2%的盐酸溶液中，在料液比为1∶22的条件下，提取时间分别为3.0，2.5，2.0，1.5和1.0 h，100 ℃回流提取3次，计算育亨宾收率，确定最佳提取时间，结果显示，以育亨宾的收率为指标成分，对提取时间进行考察，当提取时间从1 h增加到2 h时，育亨宾的收率呈明显上升趋势；当提取时间从2 h增加到3 h时，育亨宾的收率呈明显下降趋势。当提取时间为2 h时，育亨宾的收率达到最大值103.7%，因此选择提取时间为2 h。

2.3.5提取温度的确定 称取2 g育亨宾粗粉，5份，分别溶于10 mL质量分数为0.2%的盐酸溶液中，料液比为1∶22，每次1.5 h，回流提取3次，在提取温度为60，70，80，90和100 ℃条件下，计算育亨宾收率，确定最佳提取温度，结果显示，以育亨宾的收率为指标成分，对提取温度进行考察，随着提取温度的升高，育亨宾的收率呈明显上升趋势；当提取温度为100 ℃时，育亨宾的收率达到最大值106.9%，因此选择提取温度为100 ℃。

2.4正交实验 根据单因素的实验结果，选取提取溶剂质量分数(A)、提取温度 (B)、料液比(C)和提取时间(D)为主要因素，每个因素各选取3个水平，以育亨宾含量为考察指标，设计L9(34)正交实验确定最佳提取工艺，正交实验因素水平见表1至表3。

表1正交实验的因素与水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素A,提取溶剂质量分数/%B,提取温度/℃C,料液比D,提取时间/h10.1801∶221.520.2901∶262.030.31001∶282.5

由表2可知，育亨宾含量为育亨宾提取工艺的考察指标，由极差R可知，各因素的影响程度依次为A>B>C>D。由表3可知，因素A(提取溶剂的质量分数)对育亨宾的提取有极显著性意义，因素B(提取温度)对育亨宾的提取有显著性意义，因素C和因素D对提取无显著性意义，可根据生产条件任取一水平，从节约能源和提高生产效率方面考虑，料液比为C1(1∶22)，提取时间为D1(1.5) h，得出较佳提取工艺，即 22倍量的水(1∶10∶6∶6)，100 ℃条件下提取3次，每次1.5 h。

2.5验证实验 根据正交实验结果，称取适量育亨宾粗粉3份，按照最终选取的工艺进行提取，育亨宾的平均收率大于103%。

表2正交实验结果

Tab.2 Results of the orthogonal experiment

编号ABCD育亨宾含量/%111115.99212226.06313336.24421236.49522316.87623127.23731325.93832136.15933216.32K118.2918.4119.3719.18K220.5919.0818.8719.22K318.4019.7919.0418.88Ⅰ6.0976.1376.4576.393Ⅱ6.8636.3606.2906.407Ⅲ6.1336.5976.3476.293R0.7670.4600.1670.113

表3方差分析结果

Tab.3 Results analysis of variance

方差来源离差平方和自由度FFα显著性A1.122248.78F0.1=9**B0.317213.78F0.05=19*C0.04321.87D0.02321.00误差02

注：*P<0.1为有极显著性意义，**P<0.05为有显著性意义。

3 讨论

本研究考察了提取溶剂、提取溶剂的质量分数、料液比、提取时间和提取温度5个因素对育亨宾提取率的影响，育亨宾树皮中有效物质以生物碱的形式存在，采用酸提取增加其溶解性，筛选出以盐酸为提取溶剂，进一步通过正交实验优化提取工艺，得到了育亨宾树皮中提取育亨宾的最佳提取条件为：质量分数为0.2%的盐酸溶液，料液比为1∶22，提取温度为100 ℃，提取3次，每次1.5 h，经工艺验证，育亨宾的平均提取率高于103%，表明本提取方法提取率高于现有报道[19]，且本研究所确定的育亨宾含量测定方法操作简单、重复性好，在生产过程中作为质量控制方法可行，该提取工艺稳定，已应用到育亨宾提取物的工业化生产中。