杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)及其双亲遗传多样性的微卫星分析

张佳佳，李 杰，张国松，2，王 涛，尹绍武，唐忠林，茆健强，王若然

( 1.南京师范大学 生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，江苏 南京 210023； 2.菏泽学院，生命科学系，山东 菏泽274000； 3.南京市水产科学研究所，江苏 南京 210036 )

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)与黄颡鱼(P.fulvidraco)均属鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，是黄颡鱼属中经济价值较高的两个种类[1-2]。由于这两种鱼具有肉嫩味美、高营养、无肌间刺等特点，深受广大消费者的喜爱[3]。瓦氏黄颡鱼主要在江、河等流水水体(如与长江支流相通的大水面湖泊、河流水体)中活动，是黄颡鱼属中个体最大的种类，据报道最大个体质量可达1850 g。与黄颡鱼相比，瓦氏黄颡鱼生长速度较快，当年苗种即达上市规格[1]，其缺点是对水体溶解氧含量的要求较高，如水体内溶解氧水平过低(<2 mg/L)，即产生浮头现象，在高密度池塘养殖中，温度超过32 ℃时泛塘死亡率大大上升[4]。黄颡鱼在我国各大水系均有分布，相比瓦氏黄颡鱼有较高的耐低氧能力，适合于池塘养殖，但存在个体小、生长速率较慢的缺点，在高密度的池塘养殖中，当年苗种较难达上市规格(80 g以上)[1]。已报道的黄颡鱼雌鱼与瓦氏黄颡鱼雄鱼杂交子代体型厚实，与双亲相比具有明显的生长优势，饵料系数低，具有一定的抗病能力，近年来已成为水产养殖较受欢迎的品种之一[5]。目前关于杂交黄颡鱼的研究主要集中在繁殖育种、养殖技术、形态、生长和肌肉营养价值分析等方面[6-10]。如李镕等[8]采用主成分和聚类分析的方法对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代的形态进行分析，结果显示，杂交黄颡鱼与黄颡鱼的亲缘关系更近，且体色接近黄颡鱼；王峰[9]对杂交黄颡鱼及其双亲的生长速度和肥满度等进行比较，结果表明，杂交黄颡鱼的绝对质量增加率分别比亲本黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼高0.0097、0.0459 mm/d；张佳佳等[10]对杂交黄颡鱼的肌肉营养成分进行分析，结果表明，杂交黄颡鱼属优质营养资源，且杂交黄颡鱼的粗蛋白含量高于双亲黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼。已有的研究结果表明，杂交黄颡鱼具有一定杂种优势，有很好的选育潜力和市场前景，因此分析杂交黄颡鱼的遗传背景非常必要，但关于杂交黄颡鱼遗传分析鲜有报道。

微卫星DNA又称为短串联重复序列或简单重复序列[11]，是一种在真核生物基因组中广泛分布的DNA片段。作为近年来发展迅速、应用广泛的分子标记之一，微卫星DNA具有种类多、分布广、符合孟德尔共显性方式遗传、多态信息含量高、操作较为简单等优点，是种群结构分析、个体识别、遗传图谱构建、种群评估、遗传多样性鉴定等研究的理想分子标记[12]，现已在珊瑚鱼(Lutjanuscarponotatus)[13]、许氏平鲉(Sebastesschlegeli)[14]、星斑川鲽(Platichthysstellatus)[15]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[16]等鱼类中得到广泛应用[17-18]。国内外关于黄颡鱼属的微卫星相关研究主要集中在黄颡鱼微卫星标记的开发[19-21]，运用微卫星标记分析不同地理群体黄颡鱼的遗传结构及亲缘关系[22-23]等方面。未见运用微卫星标记进行杂交黄颡鱼及其亲本遗传多样性及遗传背景分析的相关报道。因此，本研究利用9对多态性较高的微卫星引物对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交子代进行遗传多样性比较分析，为黄颡鱼属这3种鱼类群体遗传评估和杂交黄颡鱼新品种选育提供理论依据和基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料瓦氏黄颡鱼、黄颡鱼和杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)取自南京市水产科学研究所，3种鱼群体均为2016年6月通过人工繁殖获得，亲本均采自长江中下游地区。其中黄颡鱼体质量(12.45±3.12) g；杂交黄颡鱼体质量(18.45±5.01) g；瓦氏黄颡鱼体质量(16.35±3.73) g，3种鱼均健康无疾病，分别选取32尾，剪取适量尾鳍，保存于加入无水酒精的1.5 mL无菌离心管中。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

使用上海捷瑞生物公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)对瓦氏黄颡鱼、黄颡鱼、杂交黄颡鱼尾鳍DNA进行提取，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性与纯度，-20 ℃保存备用。

1.2.2 微卫星引物

首先从瓦氏黄颡鱼转录组EST序列筛选获得53个微卫星多态性位点，在这些位点所设计的引物中有42对能够在黄颡鱼和杂交黄颡鱼中稳定扩增(表1)，挑选等位基因数较多、多态性好的9对引物用于黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼3个群体的遗传分析，引物信息见表2，引物由生工生物工程公司合成。

表1 瓦氏黄颡鱼53个微卫星位点的特征及各个遗传参数

续表1

位点引物序列(5'→3')重复碱基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE扩增结果登录号P36F:CAACGACTGGAGGTCAAACAR:AGCTGACGGAACTGTTACTGC(GT)855285～315120.6250.7900.7610.001**-KP735121P37F:TGAAATAGCTTGCCGTTGTGR:TGGATTGTTGTGAGGTTGGA(AC)853251～25740.5000.5630.4570.607+KP735122P39F:GGGATTAGGGTGTAGGGAGCR:CCCTAAGTTGAGCGCCTTTA(AC)858258～26850.7500.6550.6010.658+KP735123P40F:TCACTACCGGGGACTGACTTR:TAAAAATTCACCGGCCATTC(GT)853258～26020.1250.2220.1950.051+KP735124P43F:AGCATTGGAGCCGATCATACR:AGGCACCCTCAGTAAGAGCA(TG)859275～28130.3440.3040.2791.000+KP735125P44F:AGCAGCCTCTTCAACCGTTAR:CAGGTAGAGTGGGAGTGATGG(TG)858257～26130.1880.2940.2560.027*+KP735126P45F:TCAAACTGGGCAAAAACTCCR:AACGAAGGGGGTTTTCAGAT(AC)853249～279130.8130.8640.8340.004**+KP735127P49F:TTTTCTGAAGGAGACGTCGGR:CCAGGCAGGATGGTTACCT(AC)859272～27840.5630.5860.5370.042*-KP735128P50F:CTTCCCAGAAGTCTGAACGGR:TCCAGGATCAGGACATCACA(AAG)859268～28970.9380.7480.6980.649-KP735129P65F:CCACTGGCAAAACATTGAAAR:TCAGACCCGCCTTAATATGC(TCA)753231～23730.1250.1210.1161.000-KP735130P71F:ATGATCAAACACAGTGGGCAR:AGAAGACGGGAGGAGGAGAG(CAT)758254～26030.1250.3540.2980.000**+KP735131P84F:TGCTTCCTCTCCGCTATTGTR:GCAGCCACTATTATGAGCCC(TCC)656230～23320.4060.4840.3630.462+KP735132P86F:CTGGGAAACATCCTGGAAAAR:AACCATCCTGCAGGTGAGAC(TTG)659228～24360.9380.7900.7400.157-KP735133P88F:CACATGATCGTCACCTCGTCR:TGAGGATGATTCTGCACCTG(ATG)659218～22020.7810.4840.3630.000**+KP735134P90F:TTCCCTAAATGACCTCGTGCR:ACTTTCCCCCTTTACATCCG(GTT)653259～26830.5940.5490.4370.695+KP735135P92F:CGTTCACCGTTTTTCAGAGAR:AGATGCAGCGGTGCTTTAGT(ATG)658222～24070.9380.8010.7620.302+KP735136P93F:TCACCTGCCGATTTCTATCCR:TGCAAATGAACAGAAGCAATG(AAT)653249～25530.6560.6310.5440.345+KP735137P97F:GAACTGTACGGCACACTGGAR:TTTGATCGTTGCTTTCTTTGTC(TTA)556250～25320.1250.1190.1101.000+KP735138P98F:GCTTTGTCGTGATTTGAGCAR:CTCATGTGGAATGAACGCAC(TCT)559268～28970.8440.7280.6770.765-KP735139P102F:GGGCATGCTGAGGAACTAAAR:GGTTTAAACACCTGTTCCATCA(ATT)559232～24450.4690.7850.7370.002**-KP735140

续表1

位点引物序列(5'→3')重复碱基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE扩增结果登录号P103F:GGAGCTGCCTGTCTATCTCGR:TGGACTGAAAAACTACAGGAAAA(GGT)558262～27450.5940.6670.6060.604+KP735141P111F:AGAAGTGCTGCACACCAATGR:TCCTGCCACTTGTCTAAGGAA(ATGT)558248～26450.3750.3540.3280.785+KP735142P114F:AGCGTGCTGGAGTATTGCTTR:CGGTTCAGAGGTTCACTCGT(AAAT)558281～28930.2810.4660.4110.016*+KP735143P117F:AGTCACAGACGCAGAAGCCTR:TAGCCGGAGTTACCAAATGC(TAGC)558249～26960.5310.6050.5250.133+KP735144P120F:AAACGCCAAAGAACCTGATGR:CTGACAAGACTGCAGCAAGC(TCCA)558231～24740.6250.5800.4780.506+KP735145P122F:GGCTGGTAAAATGGTGGTGTR:GAACAGTGCATGCAGGCTAA(AT)8aaa(GT)753282～28840.7500.6140.5220.008**+KP735146P123F:GGCTAGCGGCTCAATTACTGR:CTCCTGGGACATACACACCC(CA)7cgttttccttttttatgatacagtacggccacagcagggtga(GT)658254～28080.8440.7690.7230.419+KP735147P128F:TAATGAGCGGAACAGGGAAGR:ACACACAACTCACACCACCC(TG)7tacagggttgtgtgttggtgtgtgtacagggtggggtgtgctatgattgttgtgtgtgtactggatggtgtgagt(TG)658226～24450.5630.6100.5550.356+KP735148P136F:CAGACAGGAGGTGTGTGTGGR:GCAGCTGTCAGTCATGTGGT(G)11cagatgtgggcaagaattcatcctccctcagc(TG)8ttggactcgcct(TG)658273～29360.7190.6860.6210.009**+KP735149P139F:CGCTGAACTACACACACGGTR:ATCAGAGCCCATGCTGAGTT(AC)7aaaaaaaa(AT)658288～29440.5310.6590.5880.003**+KP735150P140F:TATGTGGTGGCCATGTCTGTR:TCAGACGGGAATTTGTCCTC(TG)6cgcacgcgcaagtgtgcaacccctatgtgaatgtccactgtgttgcagattttaagc(TG)758251～25530.5310.4930.4260.537+KP735151P141F:TGCTAGCAATTAGCACTGGGR:GGCATCAGGGTTTCTGGTTA(AC)7agacaaacacacacacat(AC)658279～28330.4380.4050.3540.231+KP735152P147F:GCGAGAGAGCCGTTATTTTGR:ATCTCTTTTGGCCTTTGCAC(TG)7cattttcttttttctgtatggaaattgttactgttttatgtgtgtgtaaatcctgtatttaaatc(CA)853232～24050.5000.6600.6020.006**+KP735153

续表1

位点引物序列(5'→3')重复碱基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE扩增结果登录号P148F:TGCACTTGAAGATCAGTTGTGTTR:TCGATAATTCATGATTGCCA(GAT)5gtaatttaaatgtgtttctttaaaaattcttgagtcaagcctaaaactaaggtacaataaatac(TG)7cgcgtccgtgtgtatgtgtgtattatagaatta(AT)853279～29650.4060.3570.3341.000+KP735154P153F:GGGAGAGAAGAAGGGAATGGR:CGAAAGACAAAATGGAGGGA(TC)7catcgctccaagtgcttcctcccca(TTG)553279～28230.2190.3500.3180.019*+KP735155P155F:AAACGTACCCACAGAGCCACR:TCCAAAAATGGTGTCGTTCA(GT)9cctcaggttagaagtacttcaac(CA)658291～30850.4690.6280.5470.008**+KP735156P156F:TCAATACACTCGCTGACCCAR:AGCGTCCGAACAGAACAATC(TG)6ttgtgtattagataataaagcaaaaataataaggatccagaaaagtgtgggggtttaaatagaaataagg(ATA)558289～29430.4690.4580.3621.000+KP735157P165F:TCCTGGTACACTTTCGCACAR:TGGATGGCGATCATACTGAA(TGT)5tttgtttgtttttagct(CAG)558274～28030.6250.6280.5410.961+KP735158P169F:CACTTGCACTTCTCGTGTGAR:TAAACAGCCTCACCAAACCC(GAA)5aaaaa(AT)658290～29340.6560.7410.6790.069+KP735159P173F:TAGTGTTCCTGTGAAGCCCCR:AGGGAGAGCGTTTGTGCTAA(AGC)5atcctcacagtgctgatgcgttcagtgtgcgactggtcctgagcggcagcagcattacgatcctaacgtgataaactgagcaccgtctggtctggg(GT)958272～29780.6560.8210.7840.000**+KP735160P175F:TCTCCGGCGTTGTAGAAGTTR:TGGGAATCCTCGTGATTCAT(GA)7atcacgtgagggttctgtcagctgcgcttcactcctagctcaggggcagctgtgttacgtaaacaagtcggagatgaatgatttgtgttt(AC)858268～27140.8130.6480.5690.003**-KP735161

续表1

位点引物序列(5'→3')重复碱基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE扩增结果登录号P177F:TGTCTGCGTGTGTACCTGTGR:ACGGCTCTGCTTCAGTCTGT(GT)8aagtttgtatgtccatgtgtcagtgtgtttgtccagctattcctatgtc(TG)658275～28540.6250.5520.4790.195+KP735162P184F:GTGAATTGGGTGAGTGGCTTR:GCCAAGTGGTGAAGGGATTA(GT)6(TG)658218～22230.5630.5000.4390.348+KP735163

注：Tm，退火温度；Na，等位基因数；Ho，观测杂合度；He，期望杂合度；PIC，多态信息含量；PHWE，哈德—温格平衡χ2检验；*，差异性显著(P<0.05)；**，差异性极显著(P<0.01)；扩增结果，即该位点在普通黄颡鱼和杂交黄颡鱼中的扩增情况，“+”均有有效扩增，“-”非均有有效扩增.

表2 试验所采用的9对微卫星引物的特征

1.2.3 PCR扩增及检测

PCR反应体系为10 μL：2.85 μL 2×Taq Mix，0.04 μL 10 μmol/L M13-taile正向引物，0.16 μL 10 μmol/L反向引物，0.16 μL 10 μmol/L荧光基团，1 μL 50 ng/μL模板DNA，5.79 μLddH2O。PCR扩增的反应程序：95 ℃预变性5 min；32个循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将检测到有单一条带的产物上样于ABI3500xl分析仪进行毛细管电泳，检测产物片段大小。

1.3 数据分析

利用软件GeneMarker 1.97分析微卫星位点的片段长度。利用POPGENE 1.32分析微卫星位点的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、Nei氏遗传距离以及遗传相似度。利用PIC_CALC计算多态信息含量值。根据群体间的Nei氏遗传距离，用Mega 5.0软件非加权组平均法构建群体间聚类图。

2 结果与分析

2.1 有效等位基因数、基因杂合度、多态信息含量

对9个扩增位点在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼3个群体中分别进行统计分析(表3)。黄颡鱼群体的有效等位基因数为1.0317～3.4257，平均为2.5300；瓦氏黄颡鱼群体的有效等位基因数为2.4704～5.2245，平均为3.7697；杂交黄颡鱼群体的有效等位基因数为1.47937～5.2920，平均为3.0640。黄颡鱼群体的观测杂合度为0.0312～0.7931，平均为0.2970；瓦氏黄颡鱼群体的观测杂合度为0.5312～0.9375，平均为0.7292；杂交黄颡鱼群体的观测杂合度为0.1000～0.9667，平均为0.4492。黄颡鱼群体的多态信息含量为0.0302～0.8688，平均为0.3803；瓦氏黄颡鱼的多态信息含量为0.5250～0.7836，平均为0.6746；杂交黄颡鱼的多态信息含量为0.2986～0.7871，平均为0.5696。

表3 黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼的遗传多样性信息

2.2 遗传距离及聚类分析

对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼的遗传距离和遗传相似度进行分析，由表4可见，黄颡鱼和杂交黄颡鱼的遗传相似率(0.4063)高于瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼遗传相似率(0.1621)，而黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的遗传相似率最低(0.0116)。杂交黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的遗传距离(1.8195)高于杂交黄颡鱼和黄颡鱼的遗传距离(0.9006)，低于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的遗传距离(4.4568)。根据遗传距离，用Mega 5.0软件构建系统进化树，杂交黄颡鱼和黄颡鱼先聚为一支，而瓦氏黄颡鱼属于最外支(图1)。可见杂交黄颡鱼和母本黄颡鱼的亲缘关系较近。

表4 黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼的 无偏遗传距离与遗传相似度

注：对角线以上为遗传相似度，对角线以下为遗传距离。

图1 黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼的聚类分析

3 讨 论

目前，国内外关于黄颡鱼的育种工作主要集中在选择育种和杂交育种两个方面，通过远缘杂交可以有效地增加群体遗传结构变异和遗传分化，提高群体的遗传多样性，因此杂交育种已经成为改善鱼种品质的重要手段之一[28]。微卫星分子标记作为第二代分子标记技术，具有数量多、分布广泛、易于检测等优点，已经广泛应用于物种多样性检测、分子辅助育种等方面[29]。群体的遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种适应复杂环境、维持生存和进化的基础[30]，其主要表现在等位基因数的丰富和均匀程度、遗传杂合度的大小和多态信息含量3个方面[31-32]。等位基因越丰富，遗传杂合度数值越大，多态信息含量越高，则证明群体遗传变异越高，更能够适应自然环境变化[33]。本研究中通过9对微卫星引物检测到杂交黄颡鱼的平均有效等位基因(3.0640)大于母本黄颡鱼(2.5300)，但低于父本瓦氏黄颡鱼(3.7697)。杂交黄颡鱼的平均观测杂合度(0.4492)和平均多态信息含量(0.5696)均大于母本黄颡鱼(0.2970和0.3803)，但小于父本瓦氏黄颡鱼(0.7292和0.6746)，其原因可能是黄颡鱼连续自交、选育所导致的多样性水平下降[31]，也可能是受核质作用的影响[29]；同时杂交黄颡鱼的双亲雌雄比例为200∶1，父本瓦氏黄颡鱼的遗传物质对杂交子代的贡献率较低，也可能是影响杂交黄颡鱼的遗传多样性较低的原因。另外多态性微卫星位点的选择和样本数量的大小也可能成为影响试验结果的可能因素[34]。微卫星位点的遗传变异程度可以用多态信息含量来描述，数值越高则遗传变异越大，反之则变异小[28]。根据Botstein等[35]提出的划分标准，多态信息含量>0.5的位点为高度多态性位点；0.25<多态信息含量<0.5的位点为中度多态性位点；多态信息含量<0.25的位点为低度多态性位点。本研究中黄颡鱼群体的平均多态信息含量为0.3803，为中度多态性群体；瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼群体的平均多态信息含量分别为0.6746 和0.5696，均为高度多态性群体，说明杂交黄颡鱼群体的遗传变异度较大，具有较为丰富的遗传多样性，有一定的杂交优势和良种选育潜力。同样的，利用微卫星标记分析鱼类杂种优势在斑鳜(Sinipercascherzeri)、鳜鱼(S.chuatsi)以及斑鳜(♀)×鳜鱼(♂)杂交一代、杂交二代群体遗传特征分析中有所体现[28]，其结果显示杂交一代、杂交二代群体的遗传杂合性高于双亲斑鳜与鳜鱼；红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、菊黄东方鲀(T.flavidus)及其杂交子代的遗传特征分析结果显示，杂交子代的遗传多样性高于双亲[36]；红鳍笛鲷(Lutjanuserythopterus)与千年笛鲷(L.sebea)的杂交一代也具有遗传多样性高的优势[11]。

遗传距离的大小反映了不同群体间亲缘关系的远近[37]。杂交亲本间遗传差异越大、亲缘关系越远，其后代杂种优势越明显[25]。本研究的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼两个亲本的遗传距离高达4.4568，遗传差异很大，理论上二者杂交可以产生具有优势特征的杂交品种。也有报道称，通过黄颡鱼(♀)与瓦氏黄颡鱼(♂)杂交得到的子代个体较大，生长速度较快，当年苗种即达商品规格，适应性强[1,5]，是具有杂交优势的品种，其结果也印证了本研究。本研究的杂交黄颡鱼与母本黄颡鱼的遗传距离较小(0.9006)，而与父本瓦氏黄颡鱼的遗传距离偏大(1.8195)，表明杂交黄颡鱼与母本黄颡鱼的亲缘关系更近，遗传上更偏向母本。这与李镕等[8，38]的形态分析研究结果一致，表明黄颡鱼对杂交子代的贡献率可能大于瓦氏黄颡鱼，这点也可能间接证明了杂交黄颡鱼的形态(如体色)与母本黄颡鱼更接近。总体来说，杂交黄颡鱼继承了双亲的遗传特征，但偏向于母本黄颡鱼。