网箱养殖卵形鲳鲹“烂身病”病原分离鉴定及药敏分析

涂志刚，崔 婧，严耿杰，骆丽珍，李丹萍，周永灿，邱名毅

( 1.海南省海洋与渔业科学院，海南 海口 571126; 2.海南大学 海洋学院，海南 海口 570228 )

卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)，属鲈形目、鲹科、鲳鲹亚科、鲳鲹属，俗称金鲳鱼、黄腊鲳，是一种暖水性中上层鱼类，在我国东海、南海和黄海均有分布[1]，为我国广东、广西、海南以及台湾等沿海省市深水网箱养殖的主要品种之一[2-5]。据农业部渔业渔政管理局和全国水产技术推广总站统计，2015年海南省仅深水网箱养殖卵形鲳鲹产量已达3.5×104t，占全省海水养殖鱼类产量的45%。然而，随着养殖规模不断扩大，养殖密度提高，卵形鲳鲹养殖受细菌性病原和寄生虫病原影响越来越严重，特别是刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)病爆发后，继发细菌性感染对卵形鲳鲹深水网箱养殖造成了巨大损失。据保守统计，2016年由于这两种疾病的影响，全国网箱养殖卵形鲳鲹经济损失约达5亿元，已经成为除台风外，制约我国深水网箱养殖持续健康发展的关键因素。

近年来，海南省网箱养殖卵形鲳鲹陆续出现“烂身病”的疾病。据调查，该病在海南省网箱养殖区发病率较高，且持续时间长，每年5—10月均有记录。主要症状表现为身体、背鳍、吻端或眼部有溃烂，独游、活力较差、反应迟钝，体表黏液多，背鳍发黑；解剖发现，鱼体腹部常伴有积水，肛门发红、肿胀，肝脏呈灰白。为查明该病发生的原因，于2016年5月份对海南临高后水湾和澄迈桥头深水网箱养殖区爆发的卵形鲳鲹“烂身病”进行现场调查，在病原菌分离鉴定的基础上利用药敏纸片法对病原菌进行药敏分析，旨在为海南后水湾深水网箱养殖区卵形鲳鲹“烂身病”防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验鱼类

于2016年5月自海南临高后水湾和澄迈桥头深水网箱养殖区采集到具有典型“烂身病”症状的濒死卵形鲳鲹，4 h内带回实验室，立即进行疾病常规检查并进行细菌分离(图1)。

1.2 菌株和培养基

病原菌株分离于患“烂身病”卵形鲳鲹，经鉴定后保存于-80 ℃超低温冰箱。

试验用培养基分别为2216E普通海水培养基(pH 7.6～7.8)和硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖培养基。

1.3 病原菌的分离与半致死密度的测定

1.3.1 病原菌的分离

无菌操作从病鱼的病灶体表溃疡处、肝脏、肾脏等组织进行细菌分离，接种于2216E普通海水培养基，30 ℃培养24 h后，根据菌落形态选择优势菌挑取单菌落进一步纯化培养，4 ℃保存备用。

图1 健康卵形鲳鲹(左)和患有“烂身病”卵形鲳鲹(右)

1.3.2 人工感染

自患病卵形鲳鲹分离的菌株分别用2216E普通海水培养基30 ℃摇床培养16～18 h，6000 r/min离心5 min，弃上清液，加入无菌生理盐水，制成1.47×108cfu/mL的菌悬液，腹腔注射10尾卵形鲳鲹，注射量为0.2 mL/尾，设置3个重复组。对照组腹腔注射等量无菌生理盐水。置于(30±1) ℃圆形桶中充气养殖，连续观察7 d，记录各组试验鱼活动情况、患病情况及死亡数，并从具有典型“烂身病”的试验鱼肝脏等组织再次进行细菌分离。

1.3.3 半致死密度的测定

用无菌生理盐水对1.47×108cfu/mL的菌悬液进行10倍梯度稀释，以0～10-3稀释度的菌悬液分别腹部注射，对照组注射等量无菌生理盐水。每组设置3个重复组，置于水族箱中饲养。连续观察7 d并记录这组试验鱼的活动情况与死亡数，用Reed-Muench 法计算半数致死密度[6]，将单位质量半致死密度低于106cfu/(mL·g)菌株确定为强毒株。

1.4 病原菌形态学观察和生理生化特征

将纯化的菌株划线接种于硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖培养基，30 ℃培养24 h后，观察菌落特征。同时进行革兰氏染色和电镜负染，观察菌体形态特征，其他各项生理生化指标的测定参照文献[7]描述的方法进行。

1.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

扩增16S rDNA的正向引物为P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物为Pr：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′[8]。在25 μL的PCR反应体系中含有10×PCR缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Taq E聚合酶0.2 μL，引物P1和引物Pr各1 μL，模板1 μL，无菌水17.3 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次；最后72 ℃温育10 min，4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后，送生工生物工程(上海)有限公司测序。

将分离菌株16S rRNA基因序列与自美国国立生物技术信息中心数据库中获得的其同属细菌的16S rRNA基因序列一起，运用Mega软件进行序列排比，生成mas格式文件。通过自举分析进行置信度检测，自举数据集为1000次。采用邻位相接法构建系统进化树。

1.6 分离菌株药敏特征检测

药敏试验参照美国临床和实验室标准协会抗微生物药物敏感性试验执行标准，采用纸片法进行。分离菌株接种2216E普通海水液体培养基，30 ℃振荡培养24 h，配制密度为1.47×108cfu/mL的菌悬液，将菌液(0.1 mL/皿)均匀涂布于2216E普通海水固体培养基，按操作要求贴上药敏纸片，每种纸片共3个重复，30 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径，并根据同一药敏纸片3个重复组的平均值判定该药物对菌株的敏感性。

2 结果和分析

2.1 病原菌分离与人工感染

自患病卵形鲳鲹肝脏中共分离到1株优势菌株QT520，以1.47×108cfu/mL的菌液腹腔注射感染健康卵形鲳鲹，导致感染鱼100%死亡(表1)。人工感染后，病鱼表现活力差、反应迟钝，体表黏液增多，背鳍发黑，腹部积水，肛门红肿以及肝脏呈灰白等症状，后期表现为体表溃烂，与采集到的患有“烂身病”卵形鲳鲹症状相似。

采用寇氏法测定该菌株对卵形鲳鲹的半致死密度为4.2×106cfu/mL，试验鱼的体质量为(17±1) g/尾，折合单位质量的半致死密度为2.5×105cfu/(mL·g)。

表1 菌株QT520的人工感染试验结果

2.2 菌落形态及生理生化特征

菌株QT520在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖培养基上生长良好，30 ℃培养24 h，菌落呈黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，中央稍隆起；革兰氏染色阴性，短杆状，稍弯曲；电镜负染显示极生单鞭毛(图2)。生理生化检测结果表明，该菌株能在35 ℃生长，氧化酶和接触酶均为阳性，能利用葡萄糖、柠檬酸钠，不能利用甘露醇、肌醇、山梨糖及蔗糖；精氨酸双水解酶呈阴性；硝酸盐(还原)呈阳性(表2)。该菌株与哈维弧菌(Vibrioharveyi)参考菌株ATCC14126相比，除不能利用甘露醇，赖氨酸脱羧酶以及鸟氨酸脱羧酶以及吲哚试验均为阴性外，其他结果一致。

图2 菌株QT520革兰氏染色(a)及电镜负染图片(b)

鉴定项目菌株QT520哈维弧菌ATCC14126鉴定项目菌株QT520哈维弧菌ATCC141264 ℃生长--蜜二糖--30 ℃生长++Kohn明胶++35 ℃生长++赖氨酸脱羧酶-+40 ℃生长--鸟氨酸脱羧酶-+革兰氏染色--脲素酶--运动性++色氨酸脱氨酶--培养基生长颜色黄色黄色葡萄糖++0% NaCl生长--甘露醇-+3% NaCl生长++肌醇--6% NaCl生长++山梨醇--8% NaCl生长++蔗糖--10% NaCl生长--硝酸盐(还原)++氧化酶++吲哚试验-+接触酶++O/129(10 μg)--发光--O/129(150 μg)++精氨酸双水解酶--阿拉伯糖--梓檬酸钠++

注：+：反应阳性；-：反应阴性.

2.3 16S rRNA系统树分析

16S rRNA基因序列构建的系统进化树结果(图3)表明，菌株QT520与哈维弧菌聚为一支，表明菌株QT520与哈维弧菌亲缘关系最近。经16S rRNA基因序列比对进一步证实，菌株QT520与哈维弧菌菌株同源性达到99.9%。因此，综合形态学、生理生化特征以及测序结果，确定菌株QT520为哈维弧菌。

2.4 药敏特征

哈维弧菌QT520对18种抗生素的敏感性结果见表3，该菌株对多西环素、利福平、先锋哌酮、头孢吡肟、派拉西林、头孢曲松、头孢哌酮和庆大霉素均敏感，但对四环素、链霉素、卡那霉素、头孢氨苄、头孢拉定和头孢克肟表现为耐药。

药物名称药量μg/片抑菌圈直径mm敏感性判断标准(R,I,S)mm多西环素3025S≤12,13～15,≥16利福平525S≤16,17～19,≥20先锋哌酮(舒巴坦)7528S≤15,16～20,≥21头孢吡肟3024S≤14,15～17,≥18头孢噻肟3020I≤14,15～22,≥23头孢氨苄3010R≤14,15～17,≥18哌拉西林19925S≤17,18～20,≥21卡那霉素300R≤13,14～17,≥18链霉素106R≤11,12～14,≥15头孢曲松3030S≤13,15～21,≥22头孢唑啉3015I≤14,15～17,≥18头孢拉定3010R≤14,15～17,≥18头孢克肟510R≤15,16～18,≥19恩诺沙星525S≤16,17～22,≥23新霉素3017I≤16,17～23,≥24头孢哌酮7525S≤15,16～20,≥21四环素3013R≤14,15～18,≥19复方新诺明017I<10,10～19,>19庆大霉素1015S≤12,13～14,≥15

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感.

3 讨 论

卵形鲳鲹为近年来海南、广东和广西等地深水网箱养殖的主要品种，相关病害研究较少，早期周永灿等[9]对海南省卵形鲳鲹大面积死亡原因进行了调查，分离到一株嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia)；王瑞旋等[10]在陵水调查分离到了一株卵形鲳鲹致病菌——美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaessp.piscicida)；黄婷等[11]报道了广西网箱养殖卵形鲳鲹感染海豚链球菌(Streptococcusiniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)的病例。然而随着深水网箱养殖快速发展，养殖规模和养殖密度不断加大，养殖的病害也日趋严重，其中由细菌引起的“烂身病”已成为海南后水湾深水网箱养殖区养殖的卵形鲳鲹主要病害类型之一。据监测数据显示，该病的发病高峰期为每年的3—5月和8—11月，此时养殖水域平均温度25～30 ℃，与弧菌爆发的高峰期吻合[12]。每年进入8—11月，养殖卵形鲳鲹的摄食和代谢等活动旺盛，会引起养殖水体中残饵和粪便增多，加上高密度养殖使网箱内外水体交换能力下降，从而有利于病原菌的滋生。对该季节后水湾深水网箱养殖区弧菌总数分析表明，养殖网箱内弧菌密度达3.5×103cfu/mL，是网箱外及非养殖的外海对照区的50倍和1000倍[12]，这可能为深水网箱养殖卵形鲳鲹疾病爆发的主要诱因。

本试验从患有“烂身病”卵形鲳鲹肝脏中分离到一株优势菌株QT520，经回归感染试验确定其为病原菌。菌株QT520在形态学和生理生态特征方面与哈维弧菌参考菌株最为接近。通过16S rRNA基因序列比对进一步证实，菌株QT520与哈维弧菌菌株同源性达99.9%。综合形态学、生理生化特征以及测序结果，确定菌株QT520为哈维弧菌。哈维弧菌QT520对卵形鲳鲹的单位质量半致死密度为2.5×105cfu/(mL·g)，属于强毒菌株。已有研究表明，哈维弧菌对石斑鱼(Epinephelus)、高体(Serioladumerili)和大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)均有较强的致病力[13-18]。陈献稿等[15]分离到的哈维弧菌EcGY020401对斜带石斑鱼(E.coioides)的半致死剂量达2.7×106cfu/g，梅冰等[14]分离到的哈维弧菌HS08001对斜带石斑鱼的半致死剂量达1.05×104cfu/g；徐先栋[19]研究了46株哈维弧菌对斜带石斑鱼攻毒的毒性，其中有18株菌株属于强毒株。

养殖过程中不合理使用抗生素，如误用、滥用抗生素均会提高水体中病原菌的耐药性。不同时间、不同养殖场分离到的哈维弧菌对同一种药物的敏感性差异较大。已有研究表明，哈维弧菌HS08001菌株仅对庆大霉素、氯霉素和利福平3种药物高度敏感，对链霉素、卡那霉素和青霉素等18种抗菌药物不敏感[14]；哈维弧菌EcGY020401对利福平、四环素、喹诺酮类及头孢曲松等抗生素较为敏感[15]。本次药敏试验结果表明，哈维弧菌QT520株与HS08001株、EcGY020401株有一定的差异，对利福平、庆大霉素和多西环素等9种药物敏感，对四环素、链霉素和卡拉霉素等6种药物具有耐药性。因此，在实际养殖过程中可以参考使用利福平和庆大霉素等敏感性药物来防治该病害。

4 结 论

本试验自海南省深水网箱养殖的患烂身病的卵形鲳鲹中分离到1株优势菌株QT520，经过形态学、生理生化特征以及16S rRNA基因序列比对，将该菌株确定为哈维弧菌。人工感染试验表明，哈维弧菌QT520对卵形鲳鲹的单位质量半致死密度为2.5×105cfu/(mL·g)，属于强毒株型。药敏分析结果显示，哈维弧菌QT520对利福平、庆大霉素和多西环素等9种药物敏感，而对四环素、链霉素和卡那霉素等6种药物耐药。