淮河源区群体遗传多样性研究

方冬冬，顾钱洪，周传江，孟晓林，李学军，聂国兴

( 河南师范大学 水产学院，河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南 新乡 453007 )

1 材料与方法

1.1 样本采集

2015年7月—2016年4月，采集河南省信阳市淮河源区不同河流10个地理群体的样本，采样站位分别位于谭家河、南湾、高店乡、九龙河、小潢河、泼陂河、邬桥、李渡口、九曲河、灌河。具体采样信息见图1、表1。

图1 样品采集图(图中黑色圆圈表示采样站位)

1.2 DNA的提取、扩增与测序

DNA提取的方法是取其左侧鳍条或是背侧肌肉，置于无水乙醇中。采用标准的酚—氯仿法提取基因组DNA。用1.2%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和含量，并将合格的基因组DNA稀释到100 μg/L，保存好后用于后续试验。用核基因RAG2和线粒体基因Cytb作为分子标记，扩增目的片段。RAG2基因和Cytb基因分别采用通用引物：RAG2-108f(5′-CCVARACGCTCATGTCCAAC-3′)，RAG2-1324r(5′-TGGARCAGWAGATCATKGC-3′)[11]；Cytb_F2(5′-AACCACCGTTGTATTCAACTACAA-3′)，Cytb_R2(5′-ACCTCCGATCTTCGGATTACAAGACCG-3′)[12]。PCR反应总体积均为50 μL，其中10×Taq Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA 模板 20 ng，ddH2O 补足体积。样品在BIO-RAD PCR仪上进行扩增，RAG2的反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃最后延伸7 min。Cytb的反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃最后延伸8 min。PCR产物使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后经过纯化，送武汉天一辉远生物科技有限公司进行双向测序，测序引物与PCR引物相同。

1.3 数据统计与分析

测序得到的每个个体序列进行组装、校正，得到的一致序列后在GenBank中进行BLAST搜寻，确认为目的片段序列用于后续数据分析。使用ClustalX 2软件进行多重比对并辅以人工校对。使用DnaSP 5.10软件对单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样性、多态位点、平均核苷酸差异数等遗传多样性参数进行计算[13]；使用MEGA 6.0软件计算群体间的遗传距离[14]，使用NETWORK 5.001软件构建单倍型之间的进化关系图。使用ARLEQUIN 3.0软件中的AMOVA方法分析群体间的遗传结构和遗传变异[15]。先将的10个群体划分为1个组群，以验证种群间是否具有显著的遗传分化，然后按不同河流将的不同群体划分为4个组群，验证是否存在显著的地理结构；采用遗传分化参数评价种群间的遗传分化程度；采用Fu′sFS检验和Tajima′sD进行中性检验，结合核苷酸错配分布图推断群体历史是否发生近期扩张。利用MIGRATE-n v 3.0[16]计算群体间迁移率。

2 结 果

本试验得到长度为1145 bp的RAG2基因片段，137条序列共检测到41个单倍型，其中13个为共享单倍型体，其余为群体特有单倍型，变异位点13个，约占全序列的1.13%；得到Cytb的基因片段长度为1110 bp，152条序列共检测到27个单倍型，其中有8个单倍型为群体所共享，其余为群体特有单倍型，变异位点14个，约占全序列的2.43%。

遗传多样性分析结果见表1，RAG2基因所有样本平均单倍型多样性为0.940±0.011，核苷酸多样性为0.00246±0.00057；Cytb基因所有样本平均单倍型多样性为0.915±0.011，核苷酸多样性为0.00461±0.00060。在所有独立种群中，RAG2分析结果为灌河群体的单倍型多样性与核苷酸多样性均为最低，分别为0.645±0.106、0.00090±0.00013；Cytb的分析结果显示，小潢河群体的单倍型多样性与核苷酸多样性为所有群体中最低。

表1 淮河源区10个群体代码、样本量及遗传多样性

表1 淮河源区10个群体代码、样本量及遗传多样性

群体站位经纬度基因样本数量单倍型数目单倍型多样性核苷酸多样性多态位点谭家河N 31°53'51.50″E 113°58'15.60″RAG219140.965±0.0280.00390±0.0003910Cytb2060.800±0.0540.00356±0.000459南湾N 32°06'31.70″E 114°00'16.30″RAG217110.882±0.0720.00168±0.000174Cytb2050.826±0.0360.00336±0.000458高店乡N 32°12'42.90″E 114°23'19.70″RAG2881.000±0.0630.00299±0.000296Cytb940.750±0.1120.00345±0.000477九龙河N 31°56'45.06″E 114°30'21.97″RAG215100.943±0.0400.00221±0.000175Cytb1760.721±0.0870.00344±0.000369小潢河N 31°59'19.90″E 114°55'18.30″RAG21240.803±0.0630.00094±0.000092Cytb1120.509±0.1010.00229±0.000455泼陂河N 31°46'14.29″E 114°52'34.88″RAG2840.786±0.1130.00100±0.000132Cytb1250.833±0.0690.00351±0.000448邬桥N 32°13'52.60″E 115°05'58.00″RAG21770.868±0.0500.00123±0.000123Cytb1850.641±0.0970.00323±0.000488李渡口N 32°21'17.70″E 115°15'19.40″RAG21440.901±0.0460.00180±0.000134Cytb1750.750±0.0690.00299±0.000427九曲河N 31°38'29.26″E 115°19'58.67″RAG21490.934±0.0450.00177±0.000134Cytb1560.800±0.0710.00400±0.000349灌河N 31°53'51.50″E 113°58'15.60″RAG21340.645±0.1060.00090±0.000132Cytb1340.654±0.1060.00379±0.000448总计RAG2137410.940±0.0110.00246±0.0005713Cytb163270.906±0.0120.00452±0.0005914

基于核基因RAG2序列与线粒体基因Cytb序列对淮河源区10个群体进行了AMOVA分析(表2)，RAG2的分析结果显示在总遗传变异中，组内种群间的遗传变异占24.64%，Cytb的结果略高于RAG2，组内种群间的遗传变异占总遗传变异的26.14%。按不同水系将10个群体划分为4个组群进行多层次的AMOVA分析，RAG2的分析结果显示，淮河水系各群体组间的遗传变异为0.09%，Cytb的分析结果显示，各群体组间的遗传变异为2.97%，均不具有显著性差异，遗传变异主要来自于群体内。

表2 基于RAG2、Cytb序列AMOVA分析

基于核基因RAG2序列与线粒体基因Cytb序列，利用MIGRATE软件分别计算了群体间的迁移率(表3，表4)。RAG2基因的分析结果表明，群体间的迁移率为0.21(泼陂河→九曲河)～24.02(灌河→南湾)，南湾群体与其他群体之间具有最高的单向迁入率(198.36)和最低的单向迁出率(44.2)，而九曲河群体与其他群体之间具有最低的单向迁入率(2.22)和最高的单向迁出率(61.82)。Cytb基因的分析结果表明，群体间的迁移率为0.09(谭家河→邬桥)～6.20(李渡口→高店乡)，各群体单向迁入率和单向迁出率具有不对称性，其中高店乡群体具有最高的单向迁入率，为40.00，迁入率最低的李渡口群体，为1.95，单向迁出率最高的是灌河群体，为10.47，迁出率最低的是九龙河群体，为5.05。

图2 基于RAG2序列构建的单倍型网络分析

图3 基于Cytb序列构建的单倍型网络分析

群体 每代迁移率参数(θi)谭家河→i南湾→i高店乡→i九龙河→i小潢河→i泼陂河 →i邬桥→i李渡口→i九曲河→i灌河→i合计→i谭家河0.004491.041.900.251.691.800.931.481.031.6211.73南 湾0.001510.120.320.340.570.490.130.280.450.543.25高店乡0.026274.943.762.245.004.482.826.205.095.1040.00九龙河0.001440.370.250.770.350.250.210.370.360.383.32小潢河0.000400.600.592.190.830.610.800.691.161.028.50泼陂河0.000910.170.260.300.180.290.100.270.280.262.12邬 桥0.001020.090.100.240.160.290.290.270.270.322.03李渡口0.000800.170.110.370.220.290.240.150.140.261.95九曲河0.001810.420.530.830.260.440.530.220.340.974.53灌 河0.002320.450.260.900.560.620.390.360.250.634.43合 计7.336.897.805.059.569.075.7210.169.4110.47

注：谭家河→i表示谭家河群体与其他群体间的单向迁入率，“i”表示种群，下同.

表4 基于RAG2基因计算10 个群体中的一个群体到其他群体的迁移率

表4 基于RAG2基因计算10 个群体中的一个群体到其他群体的迁移率

群体每代迁移率参数(θi)谭家河→i南湾→i高店乡→i九龙河→i小潢河→i泼陂河→i邬桥→i李渡口→i九曲河→i灌河→i合计→i谭家河0.005843.042.632.602.622.842.812.632.732.7824.68南 湾0.0484122.3822.9220.8921.7819.4422.2422.8121.8824.02198.36高店乡0.01376.06.86.46.65.66.77.36.37.759.4九龙河0.000590.270.310.380.390.270.290.340.290.382.92小潢河0.003511.671.832.101.921.551.752.051.782.1016.75泼陂河0.000580.320.310.280.300.290.300.290.290.272.65邬 桥0.001260.570.620.820.610.600.550.620.600.635.64李渡口0.016947.489.288.458.088.036.817.717.5110.3673.71九曲河0.000450.270.240.230.240.250.210.240.250.292.22灌 河0.0444819.8521.8121.2119.9620.1718.3819.6422.9820.39184.40合 计58.8444.259.061.0060.7455.6561.7059.2361.8248.55

基于RAG2基因序列与Cytb基因序列的Tajima′sD和Fu′sFs检验结果见表5，RAG2基因的Tajima′sD检验结果均为正值。Fu′sFS统计结果检验，将淮河流域的作为一个整体分析时，Fu′sFS为显著负值(P<0.001)。核苷酸错配分布图为单峰，与Fu′sFs检验结果一致。表明群体近期可能经历过快速扩张。用ARLEQUIN软件计算得知扩张参数τ为2.17680，其扩张时间约为0.059百万年。Cytb基因的中性检验(表7)和核苷酸错配分布图显示群体未经历过近期历史种群扩张。

表5 淮河源区10个群体的Tajima′D和Fu′Fs中性检验结果

表5 淮河源区10个群体的Tajima′D和Fu′Fs中性检验结果

采样点Tajima's D检验Fu's Fs检验RAG2CytbRAG2CytbTajima's DPDPFu's FsPFsP潭家河1.977050.983001.912140.98200-6.26775**0.001001.800900.81400南湾1.922500.977002.207020.98900-6.98245***0.000002.712860.89700高店乡2.245090.998002.178450.99800-4.63983**0.004001.894910.83100九龙河2.184080.991001.57250.94300-4.93622**0.002001.267430.75900小潢河1.824370.976001.881690.98100-0.463290.327005.014270.98600泼陂河1.793660.992001.876470.98000-0.965290.139001.458340.75800邬桥1.673630.964001.886290.98500-2.69156*0.021002.289670.87200李渡口2.087660.993002.090640.99500-1.989930.076001.887240.83200九曲河2.001320.987002.262630.99700-4.48394**0.006001.377250.75200灌河1.661290.972002.444620.99800-0.459670.296003.285850.92300总计0.492920.746002.708850.99700-26.46857***0.00000-4.485820.14000

注: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3 讨 论

3.1 淮河源区种群遗传多样性分析

种群遗传多样性的大小主要是由种内遗传变异的高低与遗传变异的分布格局共同作用的结果，物种的遗传多样性越高其抵抗不良环境的能力就越强[17]。物种遗传多样的降低，主要与物种数量下降有关，如过度捕捞、环境污染等[18]。单倍型多样性与核苷酸多样性是衡量物种多样性的重要指标[19]。

本研究结合核基因RAG2与线粒体基因Cytb对淮河源区10个地理群体的进行了遗传多样性分析，结果发现10个群体呈现出较高的单倍型多样性大于0.50和较低的核苷酸多样性小于0.01的模式。与其他鲤科鱼类相比，明显低于东方墨头鱼(Garraorientalis)、纹唇鱼(Osteochilussalsburyi)、眼华鳊(Sinibramamacrops)、雅罗鱼(Leuciscusleuciscusbaicalensis)，但是略高于一些鲤科经济鱼类，如贡山裂腹鱼(Schizothoraxgongshanensis)、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、长鳍吻(Rhinogobioventralis)[12,20-24]。本研究中淮河源区出现这种单倍型多样性高、核苷酸多样性低的模式，可能是种群受到瓶颈效应后迅速扩张的结果。与长江流域遗传多样性(单倍型多样性为0.9789、核苷酸多样性为0.03289)相比[5]，淮河源区遗传多样性明显偏低。一方面可能与人为干扰、过度捕捞、栖息环境变化等因素有关。陈德荫[25]在对野生鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)遗传多样性的研究中发现，由于过度捕捞、环境污染等因素的影响，导致鲮鱼野生资源不断下降，遗传多样性降低。另一方面也可能与水环境的稳定性有关，淮河水系与长江水系相比，流量、流域面积均小于长江水系。因此，相比长江水系，淮河流域水环境稳定性较差，鱼类资源更容易受到环境变化的影响从而导致遗传多样性降低[26]。

本研究中两种分子标记的研究结果基本一致，灌河、小潢河两群体均呈现出低的单倍型多样性小于0.50及低的核苷酸多样性小于0.005的模式，表明两群体在历史上可能经历过严重的瓶颈效应或是正在发生瓶颈效应。过度捕捞导致种群数量减少或是种群间不能进行正常的基因交流均会引发遗传漂变导致遗传多样性降低。Kang等[27]研究认为，水库大坝建设阻碍了鱼类种群的扩散，限制了种群间的基因交流，易产生瓶颈效应和遗传漂变，从而改变种群内和种群间的遗传多样性与种群遗传结构。灌河支流发达，水流湍急，水能资源丰富，共修建大小水库17座。水库大坝的建设阻碍了灌河群体与其他群体之间的基因交流，导致遗传多样性降低。Ginson等[18]认为，过度捕捞造成种群数量减少，加剧群体间的遗传漂变，导致种群遗传多样性降低。小潢河是途径光山县的一条重要河流，当地的渔民经常捕获作为野杂鱼出售，故小潢河群体较其他群体更易受到过度捕捞和环境变化的影响。

线粒体分子标记和核基因分子标记各自有各自的优势，但研究者更加倾向于将线粒体基因与核基因联合起来研究鱼类的遗传进化[28]。所以本研究中核基因RAG2和线粒体基因Cytb所揭示的淮河源区遗传多样性水平的不同并不矛盾，这是由于各自本身的特点决定的。因此，本研究中的灌河群体与小潢河群体受到人为因素的影响较大，需要加强对该地区鱼类资源的保护。

3.2 淮河源区种群遗传分化分析

遗传分化系数是衡量群体间遗传分化的一个重要指标[29]，当遗传分化系数大于0.25时，表示群体间的遗传分化很大[30]。本研究中对淮河源区10个群体间的遗传分化分析结果显示，核基因RAG2群体间遗传分化系数大于0.25的占40%，线粒体基因Cytb群体间遗传分化系数大于0.25的占56%。核基因RAG2群体间的遗传分化没有线粒体Cytb基因明显，原因一方面是核基因RAG2在脊椎动物进化过程中具有高度保守性，受时间和空间的严格调控[11]；另一方面是淮河水系形成于中更新世，晚更新世淮河源区干流出现，群体间的分化时间不够长，导致种群间存在特异性的基因未固定下来[31]。魏学文[32]基于核基因分子标记对中国大耳菊头蝠复合体地理学的研究中也有类似的发现。

遗传分化与基因流之间呈负相关关系，种群间的遗传分化系数越大其基因流就越小[33]。本研究中两种分子标记分析群体间的遗传分化结果一致，邬桥、李渡口群体与其他群体间的遗传分化较大，遗传分化系数大于0.25，贝叶斯推断种群间的迁移率值大小与种群间的遗传分化程度基本一致。邬桥、李渡口群体均有着较高的迁出率和较低的迁入率，贝叶斯推断种群间的迁移率值的大小直接反应了种群间基因流的大小。分析认为，邬桥水库大坝的建设阻碍了该群体与其他群体之间的基因交流，所以产生了较大的遗传分化。单红[34]对三峡水库南方鲇(Silurussoldatovimeridionalis)的遗传多样性的研究中也有类似发现，以葛洲坝为界，上游和下游各自为一支，出现了明显的遗传分化。李渡口群体位于支流与干流的交汇处，水流湍急，加上地理隔离较为明显，很少有机会与其他群体之间产生基因交流。同时人类的过度捕捞、环境污染等因素的影响导致河流的生境片段化加速了该群体与其他群体之间的遗传分化。RAG2与Cytb的AMOVA分析结果显示，虽然种群间存在着一定的遗传变异，但大部分的遗传变异存在于种群内。结合单倍型之间的进化关系，人为因素的影响对鱼类种群的遗传结构没有产生足够的影响。因此，群体间较高的基因流与较低的遗传分化致使淮河源区群体间未形成明显的群体遗传结构和谱系格局。

3.3 淮河源区条群体历史的动态研究

本研究中两种分子标记的中性检验结果与核苷酸错配分布图的结果不一致。核基因RAG2的分析结果显示，淮河源区群体近期发生过种群扩张现象，但Cytb的分析结果与RAG2结果不一致。根据RAG2基因序列间的分歧速率计算得知，群体的扩张时间大约为0.059百万年，为晚更新世时期。这与徐丹丹[35]提出的长江中上游及珠江水系的鲇鱼在晚更新世时期(0.04～0.05 百万年)发生过种群扩张时间类似。晚更新世，淮河源区正在经历第四纪冰期最后一次的构造运动，使该区域内的河流改道频繁，逐渐塑造了现代淮河源区的地形地貌特征和水系构成[36]。为上层鱼类，水系的变迁可能加剧了其种群间的遗传分化。更新世冰期由于气候寒冷，河流积水大量减少，鱼类资源大量减少[37]，淮河源区的可能当时也经历了瓶颈效应，种群数量急剧减少。进入全新世，随着气候逐渐变暖，河流积水增加，甚至某些河流发生泛洪，种群快速繁衍，群体迅速扩张。