叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定

刘怡南，彭 爽，王 虹，陈德芳，贺 扬，周 毅，耿 毅

( 1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.四川农业大学 动物科技学院 水产系， 四川 成都 611130； 3.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014 )

叉尾斗鱼(Macropodusopercularis)属鲈形目、攀鲈亚目、丝足鲈科，为小型淡水观赏鱼类；其色彩艳丽、体形优美，备受各国观赏鱼爱好者追捧，被誉为“天堂鱼”[1]。叉尾斗鱼肉瘤病是养殖过程中出现的一种慢性皮肤瘤，主要症状为患病鱼的头部、躯干和鳍条聚集出现成串或成团的白色半透明状囊肿物；该病不会导致鱼类大规模死亡，但会严重影响观赏价值。1975年澳大利亚学者最早描述了叉尾斗鱼体表出现的“覆盆子样”增生物，报道指出其具有典型的淋巴囊肿细胞结构[2]。虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphocystisdiseasevirus)被认为是鱼类淋巴囊肿病的病原，其可感染全球范围内超过125种硬骨鱼类，引起鱼类浅表组织出现慢性增生性囊肿，疾病给水产养殖业造成巨大经济损失[3]。在我国，养殖鱼类云纹石斑鱼(Epinehelusmoara)[4]和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5-6]是淋巴囊肿病毒的易感宿主；2014年Xu等[7]研究证实虹彩病毒科淋巴囊肿病毒也是叉尾斗鱼重要的病原。

2015—2016年四川某观赏鱼店先后多批自广东购进的叉尾斗鱼体表均出现肉瘤状增生物，疑似为淋巴囊肿病毒感染。为确定病原，笔者收集患肉瘤病病鱼，进行了病理学检测和增生物主要衣壳蛋白基因序列分析，为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病叉尾斗鱼体长5～10 cm，8～12月龄，购自广东惠州某斗鱼养殖场；DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；D2000 Marker和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病理学观察

采用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉患病鱼致死，体表病变观察并剖检，记录病理变化并拍照。

1.3 组织病理学观察

采集皮肤、鳃、心、肝、脾、肾、脑和肠组织，室温固定于4%多聚甲醛中，常规石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色，光学显微镜观察增生物形态和组织病理变化，并拍照，Image-Pro Plus 6.0用于细胞大小测定。

1.4 组织透射电镜观察

取皮肤体表肉瘤状增生物，固定于2.5%戊二醛，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀—枸橼酸铅双染色透射电镜观察病毒形态，并拍照。

1.5 淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因检测

以肉瘤样增生组织中的基因组DNA为模板，利用淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因引物MCP-F(5′-ATGACTTCTGTAGCGGGTTCAAGTG-3′)和MCP-R(5′-CTAAAGTACAGGAAATCCCATTGAAC-3′)进行PCR扩增[7]。反应条件： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 2 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段送上海生物工程有限公司测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLSAT比对分析，采用Mega 4.1构建进化树。

2 结 果

2.1 病变观察

体表肉瘤状增生物呈白色或灰白色，半透明球形小颗粒状，单个成片或堆积成团，集中分布在患病鱼的背鳍、臀鳍、尾鳍及鳍条基部区域(图1a)。增生物早期主要散布于鳍条上，逐渐增多堆积成团伴有鳍条充血(图1b)，严重时出现蛀鳍，增生物成片扩散蔓延至体表，鱼体体色明显变淡(图1c)。解剖观察，鳃丝轻微肿胀，内脏未见明显异常。

2.2 组织病理观察

体表肉瘤状增生物是由大量直径约48.7～217.8 μm(n=11)的囊肿细胞聚集形成。皮肤上大小不等的球形囊肿细胞相互挤压堆积出现在真皮层，囊肿细胞间有大量浸润的炎性细胞和增生的上皮细胞，真皮层中黑素细胞聚集减少，而皮下肌肉组织结构清晰、肌细胞排列整齐无明显病变(图2a)。鳃丝肿胀增厚，鳃小片呼吸上皮浮离，基底黏液细胞增多，炎性细胞浸润(图2b)。脾脏出血，白髓区域减小(图2c)。其他组织器官无明显病变。

图1 体表病变a.对照(上)，鳍条感染(中)，体表感染(下)；b：鳍条充血；c：蛀鳍.

图2 组织病理变化a.皮肤；b：鳃丝；c：脾脏. E: 表皮；D: 真皮；M: 肌肉；PL: 鳃丝；Epc: 呼吸上皮；Mc: 黏液细胞；Ⅰ:脾脏出血；Ⅱ:白髓减少.

囊肿细胞仅出现在皮肤和鳍条上，在鳃、脾、肠、肝、肾等内脏组织中均未观察到囊肿样异常肥大细胞。正常细胞直径为5.1～6.4 μm，囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9～1823.8倍(按面积计算)。典型的囊肿细胞核深染位于细胞一侧，染色质成团聚集；细胞质边缘有大量网状嗜碱性包涵体，细胞膜为均质透明细带状(图3a)；膜外单层毛细血管包裹滋养着感染阶段的囊肿细胞(图3b)，衰老的囊肿细胞缩小，细胞膜均质变厚，破裂，胞内物质降解(图3c)。

2.3 透射电镜观察

体表肉瘤状增生物在透射电镜下可观察到大量形态一致的病毒粒子分布于囊肿细胞胞质内，直径约(171.5±1.2) nm，具有衣壳，切面呈六边形对称结构(图4)。

图3 囊肿细胞的显微结构a.典型囊肿细胞；b：感染阶段细胞；c:降解阶段细胞. N: 细胞核; I: 胞质包涵体; H: 透明被膜; C: 毛细血管; M: 黑素细胞; IE: 炎症上皮样细胞; D: 降解细胞.

图4 透射电子显微镜观察a.17 000×; b:40 000×.

2.4 病毒检测及发育树分析

以肉瘤状增生物组织提取的基因组DNA为模板，采用通用引物对淋巴囊肿病毒基因主要衣壳蛋白基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳观察可见在1000～2000 bp间出现单一条带(图5)，回收产物测序获得1272 bp的碱基序列，将序列在美国国立生物技术信息中心数据库中进行Blastn比对，其与淋巴囊肿病毒(登陆号 KJ408271.1)主要衣壳蛋白的序列相似性达99%。与19株不同种属的虹彩病毒进行系统发育树构建，结果表明，感染病毒株属于虹彩病毒科中淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，明显区别于肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)和蛙病毒属(Ranavirus)；其与同为观赏鱼来源的序列KJ4408271.1和AB299163.1聚为一簇，与同为叉尾斗鱼来源的毒株亲缘关系最近(图6)。

图5 PCR扩增结果1.DL2000 Marker; 2:阴性对照; 3、4:增生物样品; 5:DL2000 Marker.

图6 基于主要衣壳蛋白基因的系统发育树

3 讨 论

叉尾斗鱼肉瘤病是一种体表慢性皮肤瘤，疾病病程长，虽然死亡率不高，但会使患病鱼丧失观赏价值；随着观赏鱼全球贸易的拓展，以观赏鱼为宿主的病毒性疾病传播对各国疾病诊断和检疫工作提出了新的要求。本研究对采集的叉尾斗鱼肉瘤病病鱼进行检测，结果显示,体表白色或灰白色、半透明球形颗粒瘤状增生物是由异常肥大的囊肿细胞堆积而成，囊肿细胞是由淋巴囊肿病毒感染所致。这与报道淋巴囊肿病毒感染形成典型的皮肤浅表增生物相一致[7-8]。

虹彩病毒科分为5个属，其中感染脊椎动物的是蛙病毒属、肿大细胞病毒属和淋巴囊肿病毒属。病毒主要衣壳蛋白基因被认为是虹彩病毒科内病毒鉴定的理想目的基因。本试验扩增测序得到1272 bp的主要衣壳蛋白基因片段，在线比对与淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因相似性达99%。叉尾斗鱼属于脊椎动物硬骨鱼类，早期研究显示，其是虹彩病毒科肿大细胞病毒的易感宿主[9]。试验系统发育树分析结果显示，感染病毒与肿大细胞病毒明显进化差异，其与淋巴囊肿病毒聚为一簇，且与淋巴囊肿病毒同为斗鱼分离株的KJ408271.1亲缘关系最近，表明叉尾斗鱼肉瘤病病原为淋巴囊肿病毒。淋巴囊肿病毒广泛分布于天然水体中，是危害鱼类健康的重要病毒性病原之一。淋巴囊肿病毒与靶细胞膜上受体绑定通过内吞或膜融合方式进入胞内[10]；病毒通过抑制靶细胞凋亡和细胞分裂为病毒复制赢得时间，同时刺激细胞聚变促使靶细胞异常肿大[11]。淋巴囊肿病毒复制在胞质内形成包涵体，病毒DNA和蛋白质在其内装配完成后，脱离包涵体进入胞质，待细胞裂解后释放到组织中。本试验观察到在异常肥大的囊肿细胞内有大量的嗜碱性包涵体，电镜显示其胞质内含有装配成熟的六边形病毒粒子。同时，病毒感染可以上调胶原纤维相关基因表达，在感染细胞表面形成透明被膜[11]。本试验观察到，在囊肿细胞被膜随着病毒的感染增厚，衰老的囊肿细胞虽然细胞缩小，但有的囊膜明显增厚。此外，在感染阶段典型的囊肿细胞被膜外包裹有单层毛细血管，细胞与细胞间毛细血管丰富，这些血管支持着肿瘤细胞的新陈代谢。若在疾病治疗中能有效控制囊肿区域局部血液供应，将为肉瘤病的治疗提供新的方法。

淋巴囊肿病毒最主要的靶器官是体表皮肤下的结缔组织，也可感染鳃、脾、体腔膜、肠和头肾等组织器官，褐牙鲆感染可在鱼体表、鳃、肠壁、肝、头肾、脾中观察到囊肿细胞，而花鲈(Lateolabraxjaponicus)则仅在鳃上观察到典型囊肿细胞[12]。本试验仅在皮肤和鳍条观察到典型囊肿细胞，病变细胞局限在真皮层，其他脏器未见典型囊肿细胞或异常肿大细胞，且叉尾斗鱼脏器病变较易感动物褐牙鲆等的病理变化轻微，表明叉尾斗鱼淋巴囊肿病毒感染局限在体表，皮肤和鳍条是其感染的靶器官。养殖过程中，叉尾斗鱼在4～8月龄时达到性成熟，繁殖期打斗严重，外伤加大淋巴囊肿病毒感染风险。临床肉瘤状增生物出现在打斗易损伤的鳍条及基部区域，结合组织病理学观察，推测叉尾斗鱼感染主要途径为经皮肤感染。本研究对大体症状的观察和病理学研究为叉尾斗鱼肉瘤病的诊断和预防提供依据。