长丰鲢卵巢发育后期的肝脏、卵巢营养成分及 脂肪酸变化

全书月，李 忠，梁宏伟，罗相忠，王 丹，邹桂伟

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉，430223； 2.华中农业大学水产学院，武汉，430070)

鱼类卵巢中的成熟卵粒含有仔鱼在卵黄营养阶段所需的营养，可以在仔鱼摄食外源性营养之前，保证内环境均衡和发育[1]。针对鱼类营养构成的相关研究多有报道[2-4]，刘玉芳[5]对鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)脂类和脂肪酸组成进行了考察，分析其营养价值；罗永康[6]对鲢肌肉和内脏中脂肪酸的组成进行了分析，发现其内脏和肌肉中含有较高的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoci acid，DHA)；朱邦科等[7]对鲢早期发育阶段鱼体脂肪酸构成变化进行了分析，发现多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)中以DHA、EPA和花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)为主。脂类是鱼类生长发育过程中的重要营养物质[8]，是鱼类卵黄的主要构成物。脂类既是生物体的能源物质，也是构成组织器官生物膜的重要成分[9-11]。基于南方鲇卵黄积累过程，张耀光等[12]将卵子发生的时相划分为卵原细胞期、卵黄发生前期、卵黄发生期、卵黄成熟期等4个时期。朱云林等[13]观察尼罗罗非鱼卵母细胞分期时发现，性腺发育至Ⅲ期卵母细胞开始积累卵黄物质；且性腺发育至Ⅳ期初，卵黄开始充满卵母细胞。卵黄来源分为内源性和外源性两种途径：内源性卵黄发生是指由卵母细胞自身细胞质合成的卵黄颗粒沉积而成的卵黄物质，卵母细胞中的高尔基体、线粒体、核糖体、内质网等细胞器参与该过程；外源性卵黄发生是指由卵母细胞外的组织(如肝脏)合成的卵黄蛋白前体—卵黄蛋白原(vitellogenin，Vtg)经血液运输到滤泡细胞，随后合成卵黄蛋白(vitellin，Vn)并被加工成卵黄颗粒[14]。

长丰鲢是中国水产科学研究院长江水产研究所培育的鲢新品种[15]，具有生长快、体型好和成活率高的优点，深受广大生产者和消费者的喜爱，但存在繁殖力不高的问题，为弄清长丰鲢的繁殖性能，提高繁殖力，本研究对长丰鲢雌性亲鱼肝脏和卵巢的营养成分和脂肪酸成分进行了测定和分析，研究其在卵巢发育后期中卵黄物质的积累变化，为进一步了解繁殖期长丰鲢卵巢和肝脏营养状况，明确亲鱼的营养程度，尤其是其脂肪和必需脂肪酸水平，以此来推测亲鱼的繁殖性能[16-17]，以期为长丰鲢亲鱼培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

根据鲢的性腺发育规律，于2017年3-5月在长江水产研究所潜江长丰鲢繁育基地采集健康雌性长丰鲢亲鱼，随机选取4龄亲鱼各3尾，每隔7 d取样一次，连续取样6周，共18个样品。测量体长均值为63.5 cm、体重均值为4 800 g，解剖后取肝脏及卵巢，迅速置于-20 ℃冰箱冷冻保存。

依据卵巢的大小、形状、色泽等不同对性腺成熟度进行划分[18]。本研究中，所取卵巢分期处于Ⅳ期初、Ⅳ期中、Ⅳ期末、Ⅴ期和产卵。按照取样时间先后定为发育阶段1、2、3、4、5、6； 其中，每个发育阶段所对应的性腺分期，如表1所示。

表1 每个发育阶段所对应的性腺分期Tab.1 Gonad staging at each developmental stage

注：CL1：发育阶段1；CL2：发育阶段2；CL3：发育阶段3；CL4：发育阶段4；CL5：发育阶段5；CL6：发育阶段6。

1.2 测定方法

1.2.1 水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量检测

按照不同发育阶段，取每条鱼肝脏和卵巢分别搅碎混匀后取混合样品50 g，在-20 ℃条件下短暂保存，用凯氏定氮法测定粗蛋白的含量，索氏抽提法测定粗脂肪含量，水分和灰分分别采用烘干法(100±5)℃和马弗炉灼烧法(550±15)℃测定。

1.2.2 脂肪酸检测

脂肪酸分别为不同发育阶段3条鱼混合卵巢和肝脏样品，中国农业科学院油料作物研究所测试中心测定，并出具检测报告。

1.2.3 数据分析

利用Microsoft Office 2007、SPSS 22.0软件进行数据处理，Duncan多重比较进行单因素方差分析，显著性差异为P<0.05。

2 结果

2.1 卵巢组织学切片观察

第Ⅳ时相的细胞处于生长期的初级卵母细胞。卵细胞内卵黄物质不断沉积，卵径可达770-960 μm(表2)。根据卵黄颗粒沉积的程度，Ⅳ时相又划分为早、中、晚3个时期。

Ⅳ时相早期的主要形态特征为卵母细胞直径约778 μm，细胞质外围出现卵黄颗粒、卵黄泡，在质膜内缘出现皮层泡。细胞核体积变小，形状变得不规则(图1-1)。

Ⅳ时相中期的主要形态特征为卵母细胞直径约864 μm，卵黄颗粒充满核外空间，接近细胞核的卵黄颗粒和卵黄泡体积较大，部分卵黄颗粒开始融合成卵黄小板；卵膜周围卵黄泡较小，其中积累的卵黄物质为紫红色。细胞核中位或偏位，体积进一步变小(图1-2、图1-3)。

Ⅳ时相晚期的主要形态特征为卵母细胞直径约952 μm，卵黄物质充满细胞质，卵黄颗粒融合成卵黄小板，多为椭圆形。细胞核体积变小，发生偏位并逐步移向动物极，细小的核仁分布于细胞核中。放射带厚度增大(图1-4)。

第Ⅴ时相的卵母细胞为次级卵母细胞。卵母细胞体积达到最大，细胞直径约1 064 μm。卵黄颗粒融合成板状卵黄的趋势更明显；细胞核移至动物极，核膜消失，滤泡膜破裂，卵粒跌入卵巢腔，成为游离卵(图1-5、图1-6)。

表2 长丰鲢卵巢发育后期卵母细胞直径Tab.2 The oocyte diameter of Changfeng silver carp in the late ovarian development period /μm

注：卵母细胞直径均为3次样品重复；CL1：发育阶段1；CL2：发育阶段2；CL3：发育阶段3；CL4：发育阶段4；CL5：发育阶段5；CL6：发育阶段6。

图1 长丰鲢卵巢组织切片观察Fig.1 Histological observations for ovary of Changfeng silver carp注： 1：发育阶段1，Ⅳ期初卵巢(×40)；2：发育阶段2，Ⅳ期中卵巢(×40)；3：发育阶段3，Ⅳ期中卵巢(×40)； 4：发育阶段4，Ⅳ期末卵巢(×40)；5：发育阶段5，Ⅴ期卵巢(×40)；6：发育阶段6，产卵卵巢(×40). O：卵母细胞；N：细胞核；Nu：核仁；YG：卵黄颗粒；YP：卵黄小板；PO：初级卵母细胞；ZR：放射带；CA：皮层泡

2.2 卵巢和肝脏的营养成分

测定了雌性长丰鲢亲本卵巢发育后期卵巢中水分、蛋白质、脂肪、灰分的含量。随着性腺发育，卵巢组织中水分含量逐渐增加，尤其发育阶段6(即产卵阶段)水分显著增多(P<0.05)，所占比例范围为61.39%～70.06%；卵巢组织中蛋白质含量在前5个发育阶段逐渐增加，在发育阶段6显著减少(P<0.05)，即蛋白质含量在Ⅳ期-Ⅴ期过程中逐渐上升，在产卵阶段含量显著下降，所占比例范围为21.28%～27.18%；卵巢中脂肪含量在前5个发育阶段逐渐增多，在发育阶段6显著降低(P<0.05)，即脂肪含量在Ⅳ期-Ⅴ期过程中逐渐上升，在产卵阶段含量显著下降，所占比例范围是3.32%～5.66%；卵巢中的灰分含量稳定不变。(表3)

随着性腺发育，长丰鲢肝脏中水分含量平稳增长，所占比例范围为76.56%～80.52%；肝脏组织中粗蛋白含量基本稳定不变；肝脏中粗脂肪含量逐渐下降，尤其是产卵阶段显著下降(P<0.05)，所占比例范围为0.97%～2.47%；肝脏中的灰分含量基本稳定不变。(表3)

表3卵巢发育后期卵巢和肝脏的营养成分
Tab.3Thenutrientsinovaryandliverduringthelateovariandevelopmentperiod/%

注：水分，灰分，粗蛋白，粗脂肪均为3次样品重复；CL1：发育阶段1；CL2：发育阶段2；CL3：发育阶段3；CL4：发育阶段4；CL5：发育阶段5；CL6：发育阶段6。

2.3 卵巢和肝脏的脂肪酸组成

测定长丰鲢卵巢发育后期卵巢和肝脏组织中脂肪酸的组成及相对含量。从表4中可知，卵巢和肝脏中主要有21种脂肪酸。其中，有7种饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)，分别是C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0；7种单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)，分别是C14∶1、C15∶1、C16∶1、C17∶1、C18∶1、C20∶0、C24∶1；7种多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，分别是C18∶2、C18∶3、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶6。

不同发育阶段的卵巢中主要脂肪酸有C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶5和C22∶6，其中C16∶0、C18∶1和C22∶6所占比例较大。不同发育阶段的高度不饱和脂肪酸含量无显著区别，所占比例范围是26.4%-29.1%；但是，二十二碳六烯酸(DHA)含量总体上呈上升趋势；花生四烯酸(AA)含量在性腺发育的前5个发育阶段呈下降趋势，在发育阶段6含量上升，即AA含量在性腺发育的Ⅳ期、Ⅴ期过程中呈下降趋势，在产卵阶段含量上升；花生五烯酸(EPA)含量在性腺发育的前4个发育阶段呈上升趋势，随后呈下降趋势，即EPA含量在性腺发育Ⅳ期过程中呈上升趋势，在Ⅴ期-产卵过程中含量下降。

不同发育阶段的肝脏中主要脂肪酸有C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶4和C22∶6，其中C16∶0、C18∶0和C18∶1所占比例较大。高度不饱和脂肪酸含量在性腺发育的前5个发育阶段呈下降趋势，在发育阶段6含量增多；且在高度不饱和脂肪酸中，二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸(AA)、花生五烯酸(EPA)含量在性腺发育的前5个发育阶段呈下降趋势，在发育阶段6含量上升，即DHA、AA，EPA含量在性腺发育的Ⅳ期、Ⅴ期过程中呈下降趋势，在产卵阶段含量上升。

表4 卵巢发育后期卵巢和肝脏的脂肪酸组成Tab.4 Fatty acid in ovary and liver during the late ovarian development period %

续表4

注：脂肪酸检出限0.05%，各脂肪酸检出结果为相对含量，测量2次样品，取平均值；CL1：发育阶段1；CL2：发育阶段2；CL3：发育阶段3；CL4：发育阶段4；CL5：发育阶段5；CL6：发育阶段6。

3 讨论

3.1 卵巢和肝脏的营养成分分析

长丰鲢卵巢发育后期中卵巢和肝脏的营养成分占总重量的比例关系为：水分>蛋白质>脂肪>灰分。鱼类的生化构成主要包含水分、灰分、蛋白质、脂肪、碳水化合物等。其中碳水化合物、蛋白质和脂肪是生物体内能量的主要物质载体，但鱼体内的碳水化合物含量大约仅占0.5%，在研究中不作为重点研究指标[19]。

肝脏和卵巢间结果比较：肝脏中的水分含量>卵巢中的水分含量，平均值分别是79.03%和64.70%；肝脏中的粗蛋白含量<卵巢中的粗蛋白含量，平均值分别为13.79%和25.35%；肝脏中的脂肪含量<卵巢中的脂肪含量，平均值分别为1.52%和4.56%，可见性腺发育过程中亲鱼脂肪和蛋白质的储存主要集中在卵巢[20]。

随着性腺发育，卵巢中水分含量尤其在产卵阶段水分显著增多(P<0.05)，卵细胞吸水。卵巢内的蛋白质、脂肪含量在Ⅳ期-Ⅴ期过程中逐渐上升，在产卵阶段含量显著下降(P<0.05)，主要是由于卵细胞吸水，粗蛋白和脂肪的相对含量降低，绝对含量不变。肝脏中的粗脂肪含量显著下降(P<0.05)。研究表明，鱼类在卵巢发育过程中，卵黄物质首先在肝脏中合成，然后转移至卵巢[21]，卵巢内积累大量卵黄物质，脂类便是卵黄物质积累的主要成分之一。脂肪等营养物质在卵巢内大量蓄积，使卵巢内充满卵黄颗粒，可为受精卵及胚胎的后续发育提供能量和物质保障[22]。

3.2 卵巢和肝脏中脂肪酸组成与分析

长丰鲢肝脏和卵巢脂肪酸相对含量的不同是由组织间生理功能的差别所决定的。肝脏作为消化器官，有储存并向其他组织供给营养物质的功能，其组织内的脂肪酸构成容易受食物中脂肪酸组成的影响[23]。对于长丰鲢卵巢来说，营养物质的积累和构成不但要满足卵细胞形态结构和新陈代谢的需要，还要满足胚胎发育以及仔鱼成长的需要，所以各种脂肪酸之间合理组成的意义越发重要。

特殊脂肪酸对胚胎发育过程中系统的发生和发育有着重要作用，如高度不饱和脂肪酸DHA和EPA对鱼类的繁殖、生长和发育都有十分重要的作用[24-25]。繁殖季节长丰鲢卵巢中DHA含量相当高，这与刘玉芳[10]测得鲤鱼卵巢中的情况相似。此阶段卵巢中DHA含量大于肝脏中DHA含量，表明长丰鲢亲鱼在性腺发育过程中，可能优先从肝脏中使用DHA，并选择性的在卵巢中蓄积。长丰鲢卵巢中DHA含量占总脂肪酸含量的比例较高为12.9%～15.5%，而EPA含量占总脂肪酸含量的比例为6.0%～6.8%，低于DHA含量。许多淡水鱼类能将EPA转化成DHA[26]，DHA含量高于EPA可能与这种转化有关。长丰鲢卵巢中HUFA含量高于肝脏，尤其是DHA、AA和EPA，这是由于卵巢中富集丰富的HUFA营养可为卵子和胚胎的发育提供相应的营养[27]。HUFA在卵巢中选择性的积累规律，在多种鱼类[28-29]及贝类中均得到相应证实[30]。

肝脏是鱼类脂类和脂肪酸合成的主要器官，肝细胞通过从食物中摄取磷脂、中性脂肪等，并对脂肪酸进行一系列的分解和合成，进而促进脂肪酸代谢[31]。C16∶0是脂肪酸合成过程中优先被合成的脂肪酸之一，因此肝脏中的C16∶0含量很高。本研究中，C16∶0在肝脏中的含量最高为24.6%～33.3%。有研究表明，单不饱和脂肪酸作为能源物质最先被利用[32]。卵巢发育后期长丰鲢雌性亲鱼卵巢和肝脏中单不饱和脂肪酸含量丰富，占总脂肪酸含量分别为38.5%～43.1%和33.0%～40.7%。C18∶1在卵巢和肝脏的不饱和脂肪酸中含量最高，占总脂肪酸的含量分别为16.2%～19.8%和20.0%～26.1%，可能是主要的供能物质[33]。

Watanabe等对真鲷(Chrysophrys major)的研究表明，鱼类的营养状况是影响亲鱼繁殖性能的重要因素[34]。雌鱼卵巢的脂类含量及其脂肪酸的构成，对其繁殖能力以及受精后的胚胎发育具有重要影响[35]。了解亲鱼卵巢和肝脏的脂肪酸构成，对于确定亲鱼强化饵料或仔鱼开口饵料中脂肪酸营养水平具有一定的指导作用。