加州鲈出血病嗜水气单胞菌的分离鉴定、 致病性和体外抑菌药物研究

叶伟东，郭 成，曹海鹏，杨先乐

(1.上海海洋大学国家水生动物病原库， 上海 201306； 2.上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306； 3.水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306； 4.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心， 上海 201306)

加州鲈(Micropterussalmonides)肉质鲜美，营养丰富，深受消费者青睐，是我国重要的淡水养殖品种。据统计[1]，2016 年我国加州鲈养殖总产量达到37万多吨。然而，随着养殖密度和养殖规模的不断增大，加州鲈养殖环境日趋恶化，细菌性病害频发，阻碍了加州鲈养殖业的健康发展。其中，出血病是加州鲈主要的细菌性病害之一，具有季节长，流行广，发病率高，死亡率极高的特点，给养殖户造成了巨大损失[2]。目前，已有研究表明，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鳊(Parabramispekinensis)、黄鳝(Monopterusalbus)等多种水产动物细菌性出血病的病原菌[3-5]，也是加州鲈烂身病的病原菌[6]，但嗜水气单胞菌引起加州鲈出血病鲜见详细报道。本实验从患出血病的加州鲈肝脏组织中分离到嗜水气单胞菌LY4，通过人工回归感染试验确定了其致病性，采用API 20E生理生化鉴定和16S rRNA序列分析对其进行了鉴定，采用纸片扩散法测定了其耐药性，并采用二倍稀释法评价了35种中草药水提取液对其产生的体外抑菌作用，进一步丰富了加州鲈出血病的病原学研究资料，为加州鲈出血病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

患病加州鲈，平均体重460 g，12尾，采集自上海某养殖场；健康加州鲈，平均体重62.8 g，购于上海青浦某养殖场；API 20E细菌生化鉴定试剂条，由法国梅里埃公司生产；药敏纸片，购于杭州滨河微生物试剂有限公司；试验所用中草药购自河北省安国市御颜坊中药材有限公司。

1.2 病原菌的分离、纯化与鉴定

1.2.1 病原菌的分离

无菌条件下取试验鱼的肝、肾等组织，采用传统方法[7]在营养琼脂平板上进行病原菌株的划线分离，28 ℃恒温培养24 h后，挑取形态一致的优势单菌落进一步纯化，接种于营养琼脂斜面，28 ℃恒温培养24 h后4 ℃冰箱保藏备用；与此同时，将纯化的病原菌株接种于脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，观察菌落周围是否出现清晰、透明的溶蛋白圈，以确定病原菌株是否产生胞外蛋白酶[8]。

1.2.2 人工回归感染试验

用无菌生理盐水分别洗下营养琼脂斜面上病原菌株的菌苔，用稀释涂布平板法测定并调节菌悬液浓度为5.0×103～5.0×107CFU/mL，然后参照安伟等[9]的方法对健康加州鲈进行腹腔注射，每组鱼注射15尾，每尾注射0.2 mL。对照组注射相同剂量的无菌生理盐水，连续7 d观察鱼的发病及死亡情况，记录死亡数目，并根据概率单位图解法[10]测定病原菌株对加州鲈的半数致死剂量(LD50)。试验中及时检查并捞出死鱼，观察病症并进行病原菌再分离，验证再分离菌株与原病原菌株的一致性。

1.2.3 病原菌的鉴定

参照徐辉等[11]的方法采用API 20E细菌鉴定系统对病原菌株进行生理生化鉴定。同时，以病原菌株的基因组DNA为模板，对其16S rRNA进行PCR扩增。其中，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR的扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物的纯化与测序由上海杰李生物科技有限公司完成。将测得序列用DNAMAN软件编辑后，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中利用BLASTN软件与GenBank基因库中已知的16S rRNA基因序列进行同源性比较，选取同源性较高的序列并利用软件Mega 5.0进行多重比较后通过邻接法构建系统发育树。

1.3 病原菌对抗生素的耐药性检测

参照KB纸片扩散法[12]进行，即以涂布法接种致病菌株，然后将药敏纸片贴在培养基上，28 ℃培养24 h后，测定抑菌圈直径(mm)，根据杭州滨河微生物试剂有限公司提供的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》，确定病原菌株对抗生素的耐药性。

1.4 中草药对病原菌最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法[13]测定35种中草药(表1)水提取液对病原菌株的最小抑菌浓度(MIC)。即取含有2 mL无菌营养肉汤的试管14支并编号，于第1管中加入2 mL中草药水提取液(终质量浓度为1 000 mg/mL)至终质量浓度为500 mg/mL，混匀后再取2 mL加入第2管中至终质量浓度为250 mg/mL，依次倍比稀释直至第13管(其中2 mL弃用)，分别至终质量浓度为125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.97、0.49、0.24、0.12 mg/mL，第14管为阳性对照，不加中草药水提取液，然后分别接种病原菌株至终浓度5.0×105CFU/mL，于28 ℃恒温培养24 h后观察结果。以相同培养条件的空白无菌营养肉汤作为阴性对照。把无菌生长、稀释度最大的中草药水提取液质量浓度作为病原菌株的最小抑菌浓度。其中，中草药水提取液的制备参照张显忠等[14]的方法，即将35种中草药分别称取100 g，加1～2 L蒸馏水，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，用4层纱布过滤取药液，药渣再加蒸馏水0.5～1 L，重复以上操作取药液。合并两次药液，用文火浓缩至100 mL，即制成终质量浓度为1 000 mg/mL的中草药水提取液。

表1 试验用中草药名录Tab.1 Tested Chinese herbs

2 结果

2.1 病原菌的分离与致病性

从患病加州鲈肝脏组织中分离到1株病原菌(LY4)，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板形成的菌落周围具有清晰、透明的溶蛋白圈，说明能够产生胞外蛋白酶。人工回归感染试验结果(表2)表明，菌株LY4对健康加州鲈具有致病性，回归感染发病的加州鲈也出现体表出血、充血等与自然发病鱼相同的病症，而且从回归感染致死的鱼体内又可分离到与原菌株一致的菌株，表明菌株LY4是加州鲈出血病的病原菌。根据概率单位图解法建立的死亡概率(Y)与菌液浓度对数(X)的关系曲线方程：Y= 0.984X-0.659 5，菌株LY4对健康加州鲈的LD50为5.7×105CFU/mL。

表2 菌株LY4对加州鲈的人工回归感染实验结果Tab.2 Artificial infection of strain LY4 to healthy M.salmoides

2.2 病原菌的鉴定

API 20E细菌鉴定系统对菌株LY4的生理生化鉴定结果表明(表3)，菌株LY4为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，可信度为99.9%。此外，通过对菌株LY4的16S rRNA基因进行PCR扩增，获得了1 400 bp大小的片段，其在GenBank上的序列号为：KY694995。基于菌株LY4 16S rRNA基因序列构建的系统发育树(图1)进一步表明，菌株LY4与嗜水气单胞菌ATCC 49140(GenBank序列号：AY987754)的亲缘关系最近。综合生理生化特性鉴定与16S rRNA基因序列分析的结果，最终判定菌株LY4为嗜水气单胞菌。

表3 菌株LY4的生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain LY4

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性；“d”表示种间存在差异

图1 基于菌株LY4 16S rRNA基因序列的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain LY4 括号中的序号代表菌株的GenBank登录号;分支点上的数字代表计算1000次聚类到一起的几率;标尺刻度代表0.05%的序列差异

2.3 病原菌的耐药性

实验结果表明(表4)，菌株LY4对青霉素、阿莫西林、甲氧嘧啶、四环素、多西环素、呋喃唑酮等6种抗生素耐药，对红霉素、卡那霉素等2种抗生素中等敏感，对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、头孢他啶、头孢噻肟等9种抗生素高度敏感。

表4 菌株LY4的药敏特性Tab.4 Antibiotic susceptibility of strain LY4

注：“S”表示高度敏感；“I”表示中度敏感；“R”表示耐药

2.4 中草药对病原菌的最小抑菌浓度

由表5可知，五倍子、乌梅、地榆等3种中草药水提取液对菌株LY4具有良好的抑菌作用。具体表现在：五倍子水提取液、乌梅水提取液、地榆水提取液对菌株LY4的MIC分别为7.81、15.63和15.63 mg/mL，而赤芍水提取液对菌株LY4的MIC为31.25 mg/mL，石榴皮、山楂、熟地黄等中草药水提取液对菌株LY4的MIC均为62.5 mg/mL，其他28种中草药的水提取液对菌株LY4的MIC均不低于125 mg/mL。

表5 中草药水提取液对菌株LY4的最小抑菌浓度Tab.5 MICs of water extracts from Chinese herbs against strain LY4 mg/mL

续表5

3 讨论

3.1 嗜水气单胞菌的鉴定

一般来说，嗜水气单胞菌菌株不同，其理化特性也具有差异。李圆圆等[16]分离的鲟源嗜水气单胞菌与张晓君等[17]分离的草鱼源嗜水气单胞菌就表现出不同的鼠李糖发酵特性。因此，嗜水气单胞菌的鉴定方法通常是在生理生化鉴定的基础上，再进行16S rRNA基因序列分析鉴定[18]。本实验综合生理生化鉴定与16S rRNA 基因序列分析，判定菌株LY4为嗜水气单胞菌，鉴定结果准确可靠。此外，本实验发现菌株LY4与樊海平等[7]分离的鳗源嗜水气单胞菌JS70322NA、张友平等[15]分离的虾源嗜水气单胞菌MrM0602在利用柠檬酸钠特性方面也存在差异，可能与地区、气候、水质条件及实验室培养条件等方面的不同有关[19]。

3.2 嗜水气单胞菌的毒力与致病性

嗜水气单胞菌的不同菌株间通常存在着毒力差异。王玉娟等[20]从患病革胡子鲶分离的嗜水气单胞菌1403的LD50为6.32 ×106CFU/mL，张庆华等[21]从患病金钱鱼分离的嗜水气单胞菌Ah201416的LD50为7.35×107CFU/mL。本实验分离的嗜水气单胞菌LY4的LD50为5.7×105CFU/mL，其毒力高于嗜水气单胞菌1403、嗜水气单胞菌Ah201416，可能与嗜水气单胞菌的不同菌株携带的毒力基因的种类和数量不同有关[22]。

胞外蛋白酶是嗜水气单胞菌的重要致病因子，主要由具有较强致病性的丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等多种蛋白酶组成[15]。储卫华等[23]研究表明，嗜水气单胞菌胞外蛋白酶能够引起鱼体出现出血、充血等病症。本实验结果表明，嗜水气单胞菌LY4具有胞外蛋白酶活性，而且回归感染的鱼体也具有出血、充血等病症。因此，嗜水气单胞菌LY4对加州鲈产生的致病性与胞外蛋白酶的产生密切相关。

3.3 嗜水气单胞菌的耐药性及其中草药控制

不同分离源的嗜水气单胞菌对抗生素的耐药性往往存在差异。夏飞等[24]分离的团头鲂致病性嗜水气单胞菌对青霉素、阿莫西林、四环素耐药；邓国成等[3]分离的草鱼致病性嗜水气单胞菌对青霉素、阿莫西林也耐药，但对四环素却高度敏感。本实验分离的嗜水气单胞菌LY4除了对青霉素、阿莫西林、四环素耐药外，对多西环素这一水产养殖允许使用的抗生素也产生了耐药性。出现这些耐药性差异的原因可能是由于不同养殖地区、不同养殖环境中的菌株因接触不同的药物环境而产生耐药性变异[25]。

中草药因其来源广泛、安全性高、毒副作用小、抗耐药机制多样等优点，逐渐成为解决病原菌耐药性的新途径[26]。本实验发现五倍子、乌梅、地榆等中草药水提取液对嗜水气单胞菌LY4具有良好的抑菌效果，这与罗新等[27]、彭金菊等[28]、陈霞等[29]的研究观点相同。究其原因，可能与五倍子和地榆含有鞣质、乌梅含有有机酸等抗菌物质有关[30-32]。然而，本实验中五倍子、乌梅等中草药水提取液对嗜水气单胞菌LY4的MIC分别为7.81 mg/mL和15.63 mg/mL，而罗新等[27]、彭金菊等[28]实验表明乌梅水提取液和五倍子水提取液对嗜水气单胞菌的MIC分别为1 000 mg/mL和1.563 mg/mL，表现出抑菌效果的差异性，可能与菌株差异、中草药的采集地、采摘季节、煎煮方法等条件有关[33]。因此，在使用中草药控制加州鲈出血病嗜水气单胞菌时，应把握用药量，注意选择加工方法[34]。