4种有机磷农药对黄鳝幼鱼的急性毒性研究

罗鸣钟，杨曼绮，郭 坤，阮国良，杨代勤

(长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025)

黄鳝(Monopterusalbus)俗称鳝鱼，是我国重要的名优水产养殖种类之一。其含肉率高达70%，肌肉中蛋白质含量达18.8%,而脂肪含量低于1%[1]，具有高蛋白低脂肪的特点，味道鲜美，营养丰富，深受我国和东南亚人民的喜爱。目前，我国以及日本、朝鲜、越南等东南亚国家均开展了黄鳝的集约化养殖[2]。而湖北省作为我国黄鳝养殖的第一省，鳝鱼产量占全国的50%以上。2015年湖北省黄鳝养殖产量已达到17.21万吨，产值超百亿元，湖北省水产局已将黄鳝养殖业作为3个“百亿元”的名优水产品产业之一，在“十三五”进行优先发展和重点扶持打造[3]。目前，黄鳝养殖主要以基于池塘的网箱养殖为主。随着农业生产的发展，有机磷农药的大量使用造成水域生态环境污染，野生鳝苗种自然资源量急剧减少，苗种短缺已成为制约黄鳝养殖业发展的主要瓶颈[4]。

有机磷农药是有机磷酸脂类农药的简称，具有高效、快速、广谱性的特点，常被作为高效杀虫剂和植物生长调节剂而广泛用于农业生产中，是世界上生产和使用最多的农药品种之一。有机磷能抑制胆碱脂酶活性，引起乙酰胆碱代谢紊乱，其代谢产物能抑制神经传导，引起一系列神经综合症，对水生动物具有很强的急性毒性[5]。研究表明，在农药施用过程中，仅有1%左右作用于靶生物，其余的或残留于土壤，或通过间接途径进入水环境[6]。水体是有机磷的主要归宿，农业、渔业活动使用的有机磷农药最终会汇入水环境中，对微生物、水生动物产生较大的危害。有机磷农药对同种鱼类的不同组织和不同鱼类的同种组织中乙酰胆碱脂酶的抑制程度不同[7]，因此，有机磷农药对鱼类的毒性存在种间差异。目前，关于常见的有机磷农药如：氧乐果、乙酰甲胺磷、马拉硫磷和敌百虫等对黄鳝的急性毒性尚未见报道。

长江大学黄鳝研究团队从事黄鳝基础及应用研究近20年，于2013年取得突破，摸索出稻田网箱仿生态黄鳝繁殖技术，获得黄鳝苗种超过百万尾[8]。了解稻田常用农药对黄鳝幼鱼的毒性效应，对于完善和推广稻田网箱仿生态黄鳝繁殖技术具有重要的实践意义。本研究以黄鳝幼鱼为研究对象，采用半静态方式水生生物急性毒性实验法，研究农业生产上常用的有机磷农药：氧乐果、乙酰甲胺磷、马拉硫磷和敌百虫对其的急性毒性效应，得出半数致死浓度、安全浓度以及药物毒性蓄积程度系数，为黄鳝野生资源的保护以及苗种的人工繁育技术提供理论依据，并为池塘养殖环境的生态风险评估与管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为长江大学黄鳝研究所繁育的黄鳝幼鱼，体质量(0.03±0.01)g，体长(3.71±0.27)cm，挑选外观正常，体质健康，规格接近的个体用于实验。实验前暂养于实验室，用水为曝气的自来水，气泵连续充气，温度为(27.0±1.5)℃，pH为7.5 ～8.0，溶氧 ≥ 6.0 mg/L。

氧乐果由河北军星生物化工有限公司生产，有效成分 40%；乙酰甲胺磷由湖北沙隆达股份有限公司生产，有效成分30%；马拉硫磷由辽宁葫芦岛凌云农药化工有限公司生产，有效成分45%；敌百虫由江苏绿野农化有限公司生产，有效成分90%。按4种农药的有效浓度配置试验液。

1.2 实验方法

选择5个间距较大的试液浓度进行预实验，观察幼鱼在24 h内的情况，得出幼鱼的最大无死亡质量浓度和全部致死浓度。依照预实验的结果来设置正式实验的药品浓度梯度。

实验采用半静态方式水生生物急性毒性实验法[9]。实验期间不投饵，为保证实验药液质量浓度，每隔 24 h 更换药液1 次。根据预实验结果按等对数间距设计6个质量浓度梯度，见表1。每浓度组10尾幼鱼，设3个平行组，1个空白对照组。实验开始后6 h连续观察幼鱼的反应情况并记录，以后在24、48、72、96 h观察，记录死亡数据并及时清出死亡个体。死亡判断标准为：目测无可视动作发生 (如鳃盖运动)、 碰触尾柄后无反应，即可判断该鱼死亡。

表1 4种有机磷农药的实验浓度Tab.1 The concentrations of four organophosphorus pesticides /(mg/L)

1.3 数据处理

采用寇式法(Karber)计算半致死浓度(LC50)、安全浓度(SC)和半致死浓度的95%置信区间(CI)，并做实验浓度对数为横坐标与死亡率为纵坐标的直线回归方程[9]，利用药物毒性蓄积程度系数(MAC)来分析黄鳝体内对有机磷农药的蓄积、降减变化[10]，相关计算公式如下：

半致死浓度(LC50，mg/L)：Log LC50=Xm-d(∑p-0.5)

安全浓度(SC，mg/L)：SC=48 h LC50× 0.3 / (24 h LC50/48 h LC50)2

半致死浓度95%置信区间(CI，mg/L)：95% CI=Log LC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

药物毒性蓄积程度系数(MAC，%)：MAC=100% ×(t1LC50-t2LC50)/(t0LC50-tmLC50)

上式中：Xm为有机磷农药最大浓度的对数，d为相邻浓度的对数差值，p为死亡率(%)，为各组死亡率之和，g为存活率(%)，n为每组实验鱼尾数；t1LC50和t2LC50为观察时段t1和t2的半致死浓度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分别为实验初始、结束时半致死浓度(mg/L)。

2 结果

2.1 中毒症状

实验初期，4种农药低浓度组(浓度Ⅰ和Ⅱ)的黄鳝幼鱼均集中于烧杯底部，静止不动或偶尔游动。4 h后，4种药液的中高浓度组(浓度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的幼鳝活动逐渐变得频繁而急躁，表现为部分在水底急游后便向水面窜，接着缓慢下沉。6 h后，乙酰甲胺磷和敌百虫药液的中高浓度组便有幼鳝直立在水中，头部探向水面。随着时间的延长，4种药液高浓度组的幼鱼先后开始在底部低频率的轻微抽搐，时而游窜到水面后便很快无力下沉。8 h后，4种药液的高浓度组中部分幼鳝开始持续性地剧烈抽搐，身体扭曲且紧绷痉挛，体色由黑色变为浅灰且略透明，暗红色的血管和心脏清晰可见，表现为血管收缩、膨大的心脏在激烈的搏动。同时幼鳝在应激过程中粘液分泌量增多，马拉硫磷药液中的幼鱼应激持续时间较其他三种更长。

2.2 4种有机磷农药对黄鳝幼鱼的急性致死效应

表2显示，在96 h的毒性实验中对照组均未发生死亡，各浓度处理组幼鳝的死亡率均随药物浓度增加、实验时间延长而上升。低浓度的氧乐果和敌百虫对幼鳝急性致死效应较小，96 h的死亡率均低于10%。四种有机磷农药最高实验浓度对幼鳝急性致死效应较大，除24 h时的马拉硫磷，其余时间各组均表现出100 %的死亡率。各农药的空白对照组均无死亡现象。

表2 4种有机磷农药对黄鳝幼鱼的致死率Tab.2 Death rates of four organophosphorus pesticides to juvenile M.albus

续表2

2.3 4种有机磷农药对黄鳝幼鱼的毒性效应

根据相关计算公式[10-11]得出氧乐果、乙酰甲胺磷、马拉硫磷和敌百虫对黄鳝幼鱼的半致死浓度LC50、半致死浓度的95%置信区间CI、药物毒性蓄积程度系数MAC和安全浓度SC(表3)。半致死浓度均随实验时间的延长而下降，氧乐果对幼鳝24、48、72、96 h的半致死浓度分别为6.190、4.460、3.042、1.761 mg/L，乙酰甲胺磷为67.350、60.954、55.804、51.286 mg/L，马拉硫磷为5.058、3.981、3.404、2.992 mg/L，敌百虫为13.622、6.993、3.303、2.308 mg/L。安全浓度由低到高为：敌百虫0.553 mg/L，氧乐果0.695 mg/L，马拉硫磷0.740 mg/L，乙酰甲胺磷14.978 mg/L。四种有机磷农药对黄鳝幼鱼的药物毒性蓄积程度系数均随实验时间的延长而下降，氧乐果和马拉硫磷的MAC下降较慢，而乙酰甲胺磷和敌百虫下降较快。

根据药物浓度对数和死亡率—概率单位的关系计算出 4 种药物 24 h、48 h 和 96 h 的回归方程如表 4 所示。

表3 4种有机磷农药对黄鳝幼鱼的急性毒性特征分析Tab.3 Analysis of acute toxicity of four organophosphorus pesticides on juvenile M.albus

续表3

表4 4种有机磷农药对黄鳝幼鱼的回归方程Tab.4 Regression equations of four organophosphorus pesticides for juvenile M.albus

注：*表示差异显著(F0.05F0.01)。

3 讨论

3.1 4种农药对黄鳝幼鱼的急性毒性比较

农药对鱼类的急性毒性的强弱一般用半致死浓度(LC50)来衡量，且呈负相关，即LC50值越小，农药的毒性越强；LC50值越大，毒性越弱[12]。本研究得出了4种有机磷农药对黄鳝幼鱼 24、48、72、96 h 的LC50值，但一般较多采用 96 h LC50来确定药物对水生动物的急性毒性大小。根据国家环保总局发布的毒性分类标准[13]，急性毒性96 h LC50<0.1 mg /L为剧毒，0.1～1.0 mg /L为高毒，1.0～10.0 mg /L为中毒，>10.0 mg /L为低毒。本实验结果表明乙酰甲胺磷对黄鳝幼鱼的96 h LC50为51.286 mg/L，属低毒，氧乐果、马拉硫磷和敌百虫的96 h LC50分别为1.761 mg/L、2.992 mg/L和2.308 mg/L，均属中毒。4种农药对黄鳝幼鱼的毒性大小为：氧乐果>敌百虫>马拉硫磷>乙酰甲胺磷。本结果也表明，相对于氧乐果、马拉硫磷和敌百虫等有机磷农药，乙酰甲胺磷对黄鳝的毒性较小，在黄鳝养殖周边的稻田应尽量选择乙酰甲胺磷，而必须严格控制氧乐果、马拉硫磷和敌百虫等有机磷农药的使用量以及废药处理。

本实验中所用4种药物均属于有机磷农药，但对黄鳝幼鱼的毒性存在差异。有机磷农药对水生动物致毒作用机理主要是抑制乙酰胆碱脂酶活性，造成乙酰胆碱的大量蓄积而不能水解，致使后续神经元或效应器持续兴奋，引起痉挛麻痹等中枢神经系统症状。当组织中胆碱脂酶抑制达40%～60%时，动物可在几秒钟内死亡[14]。一般认为毒性差异的主要原因是有机磷农药分子结构差异所造成，对胆碱酯酶分子亲和力越强，毒性越大[15-16]。本实验也表明农药的物理特性如水溶性也与其毒性有一定关系，水溶性可促进毒性増强，如氧乐果水溶性高达39 800 mg/L[17]。

3.2 4种农药在黄鳝幼鱼体内的蓄积与降减的特征分析

MAC即药物毒性蓄积程度系数，常作为生物对毒物敏感程度差异的指示参数，来分析生物体对药物的蓄积与降减动态[18]。MAC值越大，即毒效蓄积幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大；MAC>0 时，蓄积作用强度大于降减作用，反之亦然。

据表3可知，4种有机磷农药的MAC值均在24～48 h间出现最大值且均大于0，表明此时间段内毒性在幼鳝体内蓄积的作用颇强，蓄积作用强度远大于降减作用，即为其死亡高峰时段；而后MAC值随着时间的延长而下降，表明幼鳝对有机磷农药毒性的抵抗能力逐渐上升，毒效渐渐消减。通过比较4种有机磷农药的MAC值，发现幼鳝对氧乐果和乙酰甲胺磷在各实验时间段蓄积幅度较为均衡，说明其毒效蓄积较强，降解毒效能力较差；在实验48～96 h幼鳝对马拉硫磷和敌百虫的MAC值下降明显，马拉硫磷实验72～96 h的MAC值是24～48 h的38.22%，敌百虫实验72～96 h的MAC值是24～48 h的15.01%，说明其降解毒效能力较强，毒效蓄积速度下降，敌百虫实验尤为明显。故在探讨农药对生物的毒性效应时，应分析药物毒性蓄积变化，充分考虑时效对其的影响。

3.3 4种农药对黄鳝幼鱼的安全性评价

黄鳝人工苗种数量紧缺已成为我国黄鳝养殖产业发展的瓶颈，如何提高黄鳝苗种繁育的规模和选育出黄鳝良种，是当前黄鳝研究的热点和难点。长江大学黄鳝研究团队虽然研发出了黄鳝稻田网箱仿生态繁育技术，可人工繁育生产黄鳝苗种，但此项技术仍不成熟，且受环境条件影响大，难以实现高效的规模繁育生产。稻田作为黄鳝生态繁育的主要场所，其土壤和水体环境对其繁殖效果产生重要影响。本研究采用急性毒性实验方法，结果表明氧乐果、马拉硫磷和敌百虫对黄鳝幼鱼属中毒，乙酰甲胺磷为低毒。但部分有机磷农药可通过对环境的吸附、移动以及生物富集等作用，长期存在于大气、土壤(沉积物)和水体环境中[19-20]。有机磷农药进入环境后对靶标和非靶标生物群落均会产生影响，其对黄鳝的慢性毒性如何，尚需进一步研究。同时，应考虑水温、pH、溶解氧、有机物、各种水生生物等诸多因子的影响，如敌百虫在碱性环境下会转化为毒性更强的敌敌畏[21]。

基于本研究结果，建议在进行黄鳝稻田繁育和养殖前，应检测土壤和水体中的有机磷农药的残留情况。同时应严格控制周边稻田中氧乐果、马拉硫磷和敌百虫等中高毒农药的使用以及废药的处理，在使用过程中需密切观察黄鳝的活动情况。