下调细胞因子信号转导抑制因子3表达对2型糖尿病大鼠糖代谢影响的研究

张旭 章爱莲 陈俊国 陆燕 王琼 余炜杰 张世杰 滕懿群 吴鸣

细胞因子信号转导抑制因子3（suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3）是 Janus 激酶/信号转导与转录活化因子3（JAK/STAT3）信号通路的主要负性调控因子，其过度表达可抑制胰岛素和瘦素信号转导，对胰岛素和瘦素抵抗的发生起重要作用[1-3]。本课题组前期研究发现2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠体内SOCS3基因表达上调[4]。因此，降低SOCS3基因的表达，可能减少对胰岛素信号抑制，改善胰岛素抵抗程度。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种在转录后水平抑制基因表达的技术，具有简单、特异及高效的特点[5]。慢病毒具有感染细胞效率高、表达持续稳定的特点，是RNAi理想的载体[6]。本研究利用慢病毒介导RNAi技术，抑制T2DM大鼠肝脏和骨骼肌SOCS3基因表达，观察血糖、胰岛素、胰岛素抵抗相关指数的变化，探讨下调SOCS3基因对T2DM胰岛素抵抗的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 5周龄健康雄性SD大鼠40只，体重180～220g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。饲养环境为无特定病原体级（SPF）条件下，室温 20～25℃、昼夜 12h交替环境中，2只/笼饲养，期间自由取食和饮水。

1.2 主要试剂 慢病毒载体质粒（pGLV1/U6/GFP）、慢病毒包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）（上海吉玛公司）；C6大鼠神经胶质瘤细胞（杭州赫贝公司）；DMEM培养液（美国Gibco公司）；链脲佐菌素（美国Sigma公司）；总RNA快速提取试剂盒（上海捷瑞公司）；荧光定量PCR试剂盒（北京天根公司）；葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛公司）；胰岛素酶联免疫试剂盒（上海抚生公司）；羊抗SOCS3一抗、兔抗 β-actin一抗（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG二抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（美国Bioworld公司）。1.3 方法

1.3.1 SOCS3短发夹RNA（shRNA）的构建 在 NCBI GenBank中检索大鼠SOCS3基因核苷酸序列（Gene ID:89829），参考小干扰 RNA（siRNA）设计原则分别设计4条21个碱基的siRNA序列，利用BLAST检索，确认siRNA序列的特异性。同时，随机设计1条同样长度的非干扰序列siRNA-Negative作为对照。分别将设计的siRNA序列合成shRNA双链DNA，以序列TTCAAGAGA作为环状结构，可以避免形成终止信号，并在3′端加入序列TTTTTT，可以终止转录。将shRNA双链DNA克隆到慢病毒载体质粒中，产生大鼠SOCS3 shRNA表达质粒，分别命名为 shRNA-N、shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。

1.3.2 SOCS3 shRNA干扰效率的检测 SOCS3 shRNA表达质粒经测序鉴定正确后转染C6大鼠神经胶质瘤细胞，48h后收集样品，实时荧光定量PCR法和Western blot法检测SOCS3 shRNA表达质粒对靶基因的干扰效率，最终确定shRNA4干扰效率最高，序列5′-CACCTTCTCCGAACGTGTCACGTTATTCAAGAGATAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′。

1.3.3 慢病毒的包装与滴度测定 将干扰效率最高的SOCS3 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒混合，加入无血清DMEM中，室温放置20min后，共转染293T细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，6h后吸去转染液，加入含10%FBS的DMEM培养液继续培养，72h后收集含慢病毒颗粒的293T细胞上清液，0.45μm滤器过滤后，超速离心浓缩2h，将浓缩病毒液置于-70℃冰箱保存，同样方法包装非干扰序列慢病毒。293T细胞按3×104细胞/孔的浓度接种96孔板中培养24h。将慢病毒原液稀释至5个梯度，每孔加入100μl稀释的慢病毒液，培养24h，再加入含10%FBS的DMEM培养液100μl，继续培养72h后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达，计数荧光细胞，结合稀释倍数测定慢病毒滴度为1.0×109TU/ml。

1.3.4 动物模型制备与实验分组 40只大鼠普通饲料适应性喂养1周后，给予高脂高糖饲料喂养。4周后，单次按30mg/kg腹腔注射1%链脲佐菌素。5d后连续3次测随机血糖，血糖值＞16.7mmol/L者确定为T2DM大鼠模型，共30只大鼠造模成功，成模率75.0%。30只T2DM大鼠采用随机数字表法分为对照组和干扰组各15只。对照组注射非干扰序列慢病毒1.5ml/次，干扰组注射SOCS3 RNAi慢病毒1.5ml/次。注射方式为尾静脉注射，时间为实验第1天和第15天，共2次。

1.3.5 标本收集 4周后大鼠禁食12h，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔内注射，麻醉成功后开胸心脏取血5ml，离心后收集血清。采集肝脏和骨骼肌组织，用预冷的0.9%氯化钠溶液洗净，于液氮冷冻后转移至-70℃冰箱保存。

1.3.6 血清学检测 采用ELISA法检测空腹胰岛素（FINS）含量，葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖（FPG）含量。胰岛素抵抗指数（IRI）=（FPG×FINS）/22.5，表示大鼠的胰岛素抵抗程度。胰岛素敏感性指数（ISI）=ln（FPG×FINS）-1，表示大鼠对胰岛素的敏感性。

1.3.7 实时荧光定量PCR法检测SOCS3 mRNA表达水平 Trizol法提取肝脏和骨骼肌组织中总RNA，按试剂说明书,逆转录合成cDNA。在实时荧光定量PCR仪上行 PCR，PCR 反应参数为：95℃ 10s，60℃ 20s，72℃30s,共 40个循环。SOCS3上游引物：5′-GGGGCCC－CTTCCTTTTCTTTA-3′，下游引物：5′-CGACAAAGATGCTGGAGGGT-3′；内参 β-actin 上游引物：5′-CCCATCT ATGAGGG TTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 采 用 2－ΔΔct法 分 析SOCS3 mRNA的表达量。

1.3.8 Western blot法检测SOCS3蛋白表达水平 提取肝脏和骨骼肌组织中总蛋白并测定浓度，按每泳道30μg蛋白上样，蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜。将PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭 1h 后，加入一抗 SOCS3（1∶500）和 β-actin（1∶500）室温孵育 2h，洗膜后加入二抗 SOCS3（1∶5 000）和 β-actin（1∶5 000）室温孵育 2h，再次洗膜后，加入化学发光试剂液，置凝胶成像仪中曝光显影以及图像分析。SOCS3蛋白表达水平以其与β-actin的比值表示。1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOCS3 shRNA的基因沉默作用 以未受转染SOCS3 shRNA的C6大鼠神经胶质瘤细胞为对照，该组细胞SOCS 3 mRNA和蛋白的表达量值定为1，计算其他各转染组细胞SOCS3 mRNA和蛋白的相对表达量，所有样本重复3次，取平均值。实时荧光定量PCR法和Western blot法检测结果显示，4个质粒干扰效率不同，其中shRNA4的干扰效率最高，可使SOCS3表达水平下调达70%，而shRNA1为25%，shRNA2为35%，shRNA3为50% ，见图1-2。

图1 C6大鼠神经胶质瘤细胞中SOCS3蛋白表达电泳图

图2 各组细胞SOCS3 mRNA表达水平

2.2 两组大鼠肝脏和骨骼肌组织中SOCS3 mRNA和蛋白表达水平比较 干扰组肝脏和骨骼肌组织中SOCS3 mRNA和蛋白表达水平较对照组均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01），表明T2DM大鼠注射SOCS3 RNAi慢病毒后，RNA特异性干扰SOCS3表达成功，见表1和图3。

表1 两组大鼠肝脏和骨骼肌组织中SOCS3 mRNA和蛋白表达水平比较

图3 两组大鼠肝脏和骨骼肌SOCS3蛋白表达电泳图

2.3 两组大鼠FINS、FPG、IRI和ISI比较 干扰组FINS、FPG和IRI较对照组均明显下降，而ISI较对照组明显上升，差异均有统计学意义（均P＜0.01），表明T2DM大鼠注射SOCS3 RNAi慢病毒后，胰岛素敏感性明显升高，胰岛素抵抗得到了改善，见表2。

表2 两组大鼠FINS、FPG、IRI和ISI比较

3 讨论

胰岛素抵抗是T2DM发病机制的核心[7]，SOCS3过度表达可能干扰胰岛素的作用效果，导致胰岛素抵抗[1-2]。肝脏和骨骼肌是胰岛素抵抗的主要发生器官[8]，研究显示，通过基因敲除技术使肝脏和骨骼肌SOCS3表达缺陷，可提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗[9-10]。因此，SOCS3可能成为治疗T2DM的靶点，通过下调SOCS3基因的表达，可能减少对胰岛素信号转导通路的抑制，提高胰岛素的生物学效应，阻止T2DM的发生、发展。RNAi是siRNA诱导细胞内同源mRNA特异性降解所引起的基因沉默现象，慢病毒载体感染细胞效率高，免疫反应小，可使目的基因整合到宿主染色体，实现长期稳定的表达。本研究根据siRNA原则设计4条序列作为SOCS3基因干扰候选靶序列，并分别构建4个SOCS3 shRNA表达质粒，转染C6大鼠神经胶质瘤细胞筛选出干扰效率最高的质粒，与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，产生滴度为1.0×109TU/ml的慢病毒颗粒。然后将其经尾静脉注射方式作用于肝脏和骨骼肌组织，实现干扰SOCS3表达的目的。结果显示，干扰组大鼠肝脏、骨骼肌SOCS3 mRNA和蛋白水平降低至对照组的70%左右。这种通过RNAi下调基因表达，具有高度特异性和高效性，避免了基因敲除的不良反应。T2DM大鼠肝脏和骨骼肌SOCS3被沉默后，FINS、FPG和IRI均明显下降，而ISI明显上升，提示下调SOCS3表达可有效地改善胰岛素对葡萄糖代谢的作用，缓解胰岛素抵抗的程度。本研究中，干扰效率最高的SOCS3 shRNA表达质粒转染C6大鼠神经胶质瘤细胞后，可使SOCS3 mRNA和蛋白水平表达下调70%，但T2DM大鼠注射SOCS3 RNAi慢病毒后，SOCS3抑制率降低为30%，也稍低于通过下丘脑注射慢病毒的干扰效果[11]，考虑可能与注射方式、慢病毒滴度、机体代谢及内环境有关。

综上所述，以慢病毒为载体介导的RNAi技术可有效发挥基因沉默作用，通过抑制T2DM大鼠SOCS3的表达，可提高T2DM大鼠胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗程度，可能成为治疗糖尿病的新手段之一。