宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表达及临床意义

曹学全 胡金蒙 杨朝晖 卢洪胜 魏科娜 章辉 顾华敏

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌居第2位，死亡率居第4位[1-2]。宫颈癌的发生、发展与多种因素、多种基因的联合作用有关，其预后受多种因素影响，治疗效果并不十分理想[3]。因此，寻找宫颈癌的特异性治疗靶点具有重要临床意义。磷脂酰乙醇胺结合蛋白4（phosphatidylethanolamine binding protein 4，PEBP4）属于PEBP家族的一个新成员，在细胞膜合成、成肌细胞分化、神经发育和肿瘤发生等生物学过程中起重要作用[4]。有研究证实PEBP4表达上调与肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药相关[5-6]。PEBP4过表达可增加肺癌细胞中蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的磷酸化水平。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3kinase，PI3K）/Akt/mTOR信号轴可能是PEBP4促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的关键分子途径[7]。本研究应用实时荧光定量PCR法及免疫组化En Vision法分别检测48例宫颈癌和48例正常宫颈组织中PEBP4和mTOR mRNA和蛋白的表达差异，分析其表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系及宫颈癌组织中PEBP4和mTOR表达的相关性，初步从基因及蛋白水平探讨其在宫颈癌发生、发展中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2008年6月至2013年12月在本院手术切除的宫颈癌标本48例，患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗等，年龄 28～73（48.0±11.0）岁。参照 WHO宫颈癌组织学分类（2003）进行组织学分化程度的判断。选取同期因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈组织标本 48 例作为对照，患者年龄 32～61（44.5±6.7）岁。每例标本的1/2在离体后20min内放入-80℃低温冰箱保存，用于实时荧光定量PCR检测；另1/2以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，用于免疫组化检测。

1.2 主要试剂 Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司，PIPA裂解液、cDNA试剂盒、SYBR Green荧光染料均购于温州长丰生物科技公司。PEBP4山羊抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司，mTOR兔抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司，En Vision通用试剂盒及DAB均购自广州基因公司。

1.3 实时荧光定量PCR法检测PEBP4和mTOR mRNA表达水平 设计PEBP4和mTOR基因PCR引物序列，具体如下：PEBP4 正 向 ：5′-ACTGGGTCTCATGATGGTGG-3′，反向：5′-CTCCATCCAGGAGGTGATCT-3′；mTOR 正向：5′-GCAGGAATAGCAAGAACTCG-3′，反向：5′-CCTCACAGCCACAGAAAGTAG-3′；内参 GADPH正向：5′-GCTCACCATGGATGATGATATC-3′，反向：5′-GCCAGATTTTCTCCATGTCGTC-3′，所有引物均由温州长丰生物科技公司合成。-80℃低温冰箱保存的标本，冰上操作，提取总RNA并检测纯度，然后转染成cDNA反应体系，37℃孵育60min。采用SYBR Green荧光染料，严格按照试剂盒说明书完成40个PCR循环。产生的熔解曲线和扩增曲线表明PCR扩增效率恒定，且已达到平台期，引物特异性好且无引物二聚体产生。收集荧光信号进行结果分析。

表1 宫颈癌组织和正常宫颈组织中PEBP4和mTOR mRNA表达水平比较

1.4 免疫组化检测PEBP4和mTOR蛋白表达 石蜡切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温孵育10min，0.1mmol/L枸橼酸盐缓冲液高压修复，3%牛血清白蛋白（BSA）封闭30min，分别加入一抗（PEBP4、mTOR抗体浓度分别为1:200和1:100）4℃过夜，再加入二抗，DAB显色，苏木素复染，封片后光学显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织作阳性对照。PEBP4表达定位于细胞质和细胞膜，mTOR表达定位于细胞质，呈现淡黄色或棕黄色颗粒分布为阳性细胞。在光学显微镜下，每张切片随机选取5个高倍视野，观察并记录细胞染色强度：无显色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。记录阳性细胞数百分比：阳性细胞数百分比≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为 3分，＞75%为4分。细胞染色强度与阳性细胞百分比计分的乘积为每例的最终积分。＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验；等级资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验；宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表达的相关性分析采用Spearman等级相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1宫颈癌组织和正常宫颈组织中PEBP4和mTOR mRNA表达水平比较 宫颈癌组织中PEBP4和mTOR mRNA表达水平均明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。PEBP4、mTOR和GADPH的实时荧光定量PCR的熔解曲线和扩增曲线见图1。

图1 PEBP4、mTOR和GADPH的熔解曲线和扩增曲线（a：PEBP4熔解曲线；b：mTOR熔解曲线；c：GADPH熔解曲线；d：PEBP4扩增曲线；e：mTOR 扩增曲线；f：GADPH 扩增曲线）

2.2 PEBP4和mTOR mRNA表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 PEBP4 mRNA表达水平与宫颈癌浸润肌层、淋巴结是否转移和临床分期均有关（均P＜0.01），而与患者的年龄和分化程度均无关（均P＞0.05）。mTOR mRNA表达水平与宫颈癌患淋巴结是否转移和临床分期均有关（均P＜0.01），而与患者的年龄、分化程度和浸润肌层均无关（均P＞0.05），见表2。

表2 PEBP4和mTOR mRNA表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

2.3 宫颈癌组织和正常宫颈组织中PEBP4和mTOR蛋白表达比较 PEBP4和mTOR蛋白在宫颈癌组织中呈强表达，而在正常宫颈组织中呈弱表达或阴性表达，见图2（插页）。宫颈癌组织中PEBP4和mTOR蛋白表达的阳性率分别为 72.92%（35/48）和 66.67%（32/48），明显高于正常宫颈组织的 10.42%（5/48）和 8.33%（4/48），差异均有统计学意义（χ2=38.571和34.844，均P＜0.01）。

2.4 PEBP4和mTOR蛋白表达阳性率与宫颈癌患者临床病理特征的关系 PEBP4蛋白表达阳性率与宫颈癌浸润肌层、淋巴结是否转移和临床分期均有关（均P＜0.05），而与患者的年龄和宫颈癌分化程度均无关（均P＞0.05）。mTOR蛋白表达阳性率与宫颈癌淋巴结是否转移和临床分期均有关（均P＜0.05），而与患者的年龄、宫颈癌分化程度和浸润肌层均无关（均P＞0.05），见表3。

表3 PEBP4和mTOR蛋白表达阳性率与宫颈癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.5 宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表达的相关性 Spearman等级相关分析显示，48例宫颈癌组织中PEBP4和mTOR mRNA表达水平呈正相关（r=0.645，P=0.000）。48例宫颈癌组织中PEBP4和mTOR蛋白表达均阳性30例，均阴性11例，宫颈癌组织中PEBP4和mTOR蛋白阳性表达呈正相关（r=0.663，P=0.000），见表4。

表4 宫颈癌组织中PEBP4和mTOR蛋白表达的相关性（例）

3 讨论

PEBP家族是由一类具有与磷脂酰乙醇胺结合能力的碱性蛋白所组成，广泛表达于多种植物和动物。PEBP4是PEBP家族的一个新成员，该家族成员都有类似的结构域[8]。PEBP4在肌肉组织中有表达，在成肌细胞分化期间，PEBP4和Raff/MEK信号通路之间可相互调控。干扰PEBP4的表达可抑制成肌细胞分化，可能与Raff/MEK信号通路的激活有关。此外，PEBP4过表达引起Akt激活，同时抑制ERK/JNK的活性[7]。有研究表明PEBP4在多种肿瘤标本中的表达均增加，与肿瘤的侵袭和转移相关，说明PEBP4在肿瘤的进展过程中起着重要的作用[6-7,9]。Huang等[10]研究发现，与低级别胶质瘤和正常脑组织比较，高级别胶质瘤PEBP4表达明显升高。多因素Cox回归分析显示PEBP4表达升高是胶质瘤预后的独立因素。PEBP4低表达的患者较那些PEBP4高表达的患者有更长的生存时间。这些数据表明，PEBP4作为预测神经胶质瘤患者肿瘤的分级和预后具有一定的临床意义。本研究发现宫颈癌组织中PEBP4 mRNA表达水平和蛋白表达阳性率均明显高于正常宫颈组织，与Wu等[11]在胃癌中的研究结果一致。本研究发现随着临床分期进展、浸润肌层加深和淋巴结发生转移，PEBP4 mRNA和蛋白表达逐渐升高，差异均有统计学意义。表明PEBP4 mRNA和蛋白高表达者，宫颈癌临床分期较高，较容易发生侵袭和淋巴结转移。Wu等[11]研究发现，沉默PEBP4的表达对胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移有明显的抑制作用。此外，PEBP4过表达可通过激活PI3K/Akt信号通路，促进胃癌细胞的发生、发展和侵袭[11]。

mTOR是重要的丝氨酸/苏氨酸蚕白激酶之一，是PI3K/Akt/mTOR信号通路的关键信号转导分子。PI3K/Akt/mTOR通路是最重要的细胞内信号通路之一。通过影响其下游多个效应分子的活化状态，调节细胞的增殖、凋亡、分化和代谢等一系列关键生理活动[12]。近年来，在多种恶性肿瘤中已发现PI3K/Akt/mTOR途径的异常活化，同时，该途径的激活也可能在肿瘤细胞过度增殖和阻断细胞凋亡中起关键作用[13-14]。本研究显示，mTOR mRNA和蛋白在正常宫颈组织均低表达，而在宫颈癌组织中表达明显升高，并且随着宫颈癌临床分期进展和淋巴结发生转移，表达水平进一步提高，差异均有统计学意义。提示mTOR mRNA和蛋白高表达与宫颈癌的转移密切相关，且患者临床分期高，预后差。

Yu等[7]报道，PEBP4的过表达促进Akt和mTOR的磷酸化，而沉默PEBP4的表达可抑制Akt和mTOR的磷酸化。因此，PEBP4可以通过PI3K/Akt/mTOR途径对肺癌细胞发挥其生物学作用。本研究中Spearman等级相关分析显示，PEBP4和mTOR mRNA表达水平和蛋白阳性表达均呈正相关。提示PEBP4过表达可能通过激活PI3K/Akt/mTOR通路，导致mTOR mRNA和蛋白表达升高，进而促进宫颈癌的发生、发展。

综上所述，本研究宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表达明显升高，且均与宫颈癌的临床分期和转移有关，PEBP4在浸润肌层有意义，而mTOR无明显意义，可能与本研究标本量较少有关。宫颈癌组织中PEBP4和mTOR mRNA表达水平和蛋白阳性表达均呈正相关，提示两者可能在同一信号通路中起调控作用。本研究为下一步采用RNA干扰和细胞培养等技术探讨沉默PEBP4表达是否能够抑制宫颈癌细胞侵袭和转移能力及调控的具体机制如何提供了理论基础和实验依据，PEBP4有望成为宫颈癌特异性治疗的新靶点。