晚期糖基化终末产物受体对宫颈癌细胞生物学行为的影响

周璐璐 朱雪洁 李如意 朱雪琼

晚期糖基化终末产物受体（receptor for advancedglycation end products，RAGE）是一种具有多配体的跨膜信号转导受体[1]。研究发现RAGE在卵巢癌[2]、乳腺癌[3]、子宫内膜癌[4]及结直肠癌[5]等肿瘤中的表达明显上调，其异常表达被认为与肿瘤的发生、发展相关。本课题组前期研究发现RAGE蛋白在正常宫颈鳞状上皮组织、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级以及宫颈鳞癌中的表达逐渐增高[6]。但是，RAGE对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其机制尚未明确。因此，本研究通过转染pLenti-C-mGFP-RAGE质粒构建RAGE基因稳定过表达的宫颈鳞癌SiHa细胞株，观察RAGE表达改变对宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 SiHa细胞及人胚肾细胞293T细胞购于中国科学院上海细胞研究所细胞库，DMEM培养基及FBS均购于美国Gibco公司。大肠杆菌菌株DH5α购于北京天根生物科技有限公司。RAGE抗体购于美国Santa-Crutz公司，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、与 Bcl-2相互作用的细胞死亡调节因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司。慢病毒空载体pLenti-C-mGFP-vector及pLenti-C-mGFP-RAGE质粒均购于美国Origene公司。CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所；PE/7-AAD购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SiHa细胞及人胚肾细胞293T细胞加到改良DMEM培养基中，放入37℃、5%CO2细胞培养箱，每隔48h换液1次。

1.2.2 质粒转染

1.2.2.1 pLenti-C-mGFP-RAGE过表达慢病毒的包装、收集 人胚肾细胞293T细胞用含10%FBS的DMEM培养基培养，接种于T75培养瓶，待细胞汇合度达60%～80%，用慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G以及目的质粒共转染，参照Lipofectamine3000说明书进行转染。转染6h后换液。转染48h后观察细胞状态，并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况并观察转染效率。用0.45μm的无菌聚偏氟乙烯（PVDF）针式过滤器过滤收集病毒液。

1.2.2.2 细胞转染及分组 将细胞进行分组培养，空白对照组为仅添加凝聚胺，空载体组为添加凝聚胺+转染空载体质粒，过表达组为添加凝聚胺+转染RAGE过表达质粒。每个培养皿中加入5×105个SiHa细胞，培养24h，细胞汇合度约50%，用终浓度为8μg/ml凝聚胺的培养基培养细胞30min，再加入1ml病毒液感染细胞，24h后换液，48h后荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.3 Western blot法检测 RAGE、PCNA、Bcl-2、Bax及Bim蛋白表达水平 分别提取各组细胞总蛋白，测定蛋白浓度。取40μg蛋白上样，常规十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜。用5%脱脂奶粉封闭2h后，分别加入 RAGE（1∶2 000）、PCNA（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bim（1∶1 000）及 GAPDH（1∶2 000）抗体，4℃孵育过夜，洗膜后分别加入辣根过氧化酶标记IgG抗体，室温下孵育2h，洗膜后将显影液加于PVDF膜上。用凝胶成像系统扫描并分析。以目标蛋白与内参蛋白条带灰度比值计算各组蛋白的相对表达量。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖情况 SiHa细胞用新鲜完全培养基重悬后，调整细胞密度为5×104/L，向96孔板加入细胞悬液100μl。置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养48h后，每孔加入CCK-8试剂10μl+DMEM 90μl，避光孵育2h。取出96孔板置于酶标仪上测定450nm处的吸光度（OD）值，每组实验重复3次。1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化各组细胞，1 000r/min离心5min，移入流式管，用预冷的PBS洗2次。每管加入500μl 1×binding buffer悬浮细胞，使细胞密度约为 1×106/ml。向流式管中加入5μl PE/5μl 7-AAD，混匀后避光孵育15min。1h内上流式细胞仪检测结果，每组实验重复3次。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤 将过表达组及空载体组SiHa细胞按5×106/只接种在裸鼠背部右侧腋下皮下。待细胞成瘤后，每隔4d测量皮下移植瘤体积，观察移植瘤生长情况，8周后处死裸鼠，称量瘤体质量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染pLenti-C-mGFP-RAGE质粒后SiHa细胞中RAGE蛋白表达水平 Western blot法检测发现，过表达组可检测GFP-RAGE融合蛋白，表明pLenti-C-mGFP-RAGE质粒成功转入SiHa细胞中，RAGE蛋白表达水平约为空载体组的（2.13±0.57）倍，见图1。

图1 转染pLenti-C-mGFP-RAGE质粒后SiHa细胞中RAGE蛋白表达的电泳图

2.2 RAGE蛋白表达增高对SiHa细胞增殖的影响 CCK-8法检测发现，过表达组SiHa细胞的增殖力均明显高于空白对照组及空载体组（均P＜0.05），空白对照组及空载体组SiHa细胞的增殖力比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示RAGE蛋白表达上调后促进了SiHa细胞的增殖，见表1。

表1 RAGE蛋白表达增高对SiHa细胞增殖的影响

2.3 RAGE蛋白表达增高对SiHa细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测发现，过表达组SiHa细胞的凋亡率为（7.10±2.67）%，明显低于空白对照组的（18.33±2.06）%及空载体组的（19.81±2.49）%（均P＜0.05），空白对照组及空载体组SiHa细胞的凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示RAGE上调后抑制了SiHa细胞的凋亡，见图2。

图2 3组SiHa细胞的流式细胞图

2.4 RAGE蛋白表达增高对SiHa细胞中增殖及凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot法检测发现，过表达组PCNA及Bcl-2蛋白表达水平均明显高于空白对照组及空载体组（均P＜0.05），而Bax/Bcl-2表达水平低于均明显低于空白对照组及空载体组（均P＜0.05），3组Bax及Bim蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2及图3。

2.5 RAGE蛋白表达增高对裸鼠宫颈癌皮下成瘤的影响 过表达组裸鼠皮下瘤体体积为（1 599.47±247.97）mm3，瘤体质量为（1.67±0.35）g，显著高于空载体组的体 积（629.92±140.59）mm3和瘤体质量（0.74±0.42）g，差异

表2 RAGE蛋白表达增高对SiHa细胞中增殖及凋亡相关蛋白表达的影响

均有统计学意义（均P＜0.05），见图4-5。

图3 RAGE蛋白表达增高后SiHa细胞中增殖及凋亡相关蛋白表达的电泳图

图4 不同RAGE蛋白表达2组裸鼠宫颈皮下瘤体体积的比较（a：空载体组瘤体图；b：过表达组瘤体图）

图5 不同RAGE蛋白表达2组裸鼠宫颈皮下瘤体体积的比较（与空载体组比较，*P＜0.05）

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，最新数据显示，2017年全美宫颈癌新发病例高达12 820例，死亡病例达4 210例[7]。Chang等[8]研究表明宫颈癌患病呈现年轻化趋势，宫颈癌和癌前病变的发病率呈上升趋势，但宫颈癌的具体发生、发展机制尚未明确。

RAGE蛋白是细胞表面分子免疫球蛋白超家族成员之一，可与晚期糖基化终末产物、高迁移率蛋白B1、溶血性磷脂酸、S-100/钙粒蛋白和β淀粉样肽等配体相互作用，激活细胞内相关信号通路，导致炎症和癌症的发生、发展[9-10]。Iotzova-Weiss等[11]利用慢病毒包裹的RAGE特异shRNA转染原代角质细胞降低RAGE基因的表达量，发现RAGE基因低表达组的细胞生长速率较阴性对照组下降了80%，提示RAGE基因水平下调后可抑制角质细胞的增殖能力，表明了RAGE基因与鳞状上皮细胞的增殖相关。Jin等[12]通过免疫共沉淀实验验证了S-100A14与RAGE在食管鳞癌细胞中相互结合并促进食管鳞癌细胞的增殖能力。Radia等[13]下调乳腺癌细胞中RAGE蛋白表达量后，发现转录因子NF-κB p65、细胞增殖标志物PCNA和G1/S-特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1）的表达量也都随之下降，说明RAGE对乳腺癌细胞的增殖具有一定的促进作用。但关于RAGE对宫颈鳞癌细胞生物学行为影响的研究尚未见报道。

本研究应用慢病毒转染技术，使SiHa细胞中RAGE蛋白稳定过表达后，发现过表达组SiHa细胞的增殖能力较空白对照组显著升高，并检测到增殖相关蛋白PCNA的表达量升高，提示RAGE基因可促进宫颈鳞癌细胞增殖。同时，裸鼠皮下成瘤实验也发现RAGE基因具有促进宫颈鳞癌肿瘤生长的能力。

Lata等[14]利用17α乙炔基雌二醇作用乳腺癌细胞系MCF-7后，提高了细胞内雌激素受体相关受体γ的表达，随后增强了细胞的氧化应激，激活了转录因子和NF-κB，最终导致了RAGE蛋白表达明显增高。进一步研究发现，RAGE基因可激活细胞周期蛋白Cyclin D1的表达而促进细胞的增殖，同时RAGE基因可促进Akt磷酸化及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，不仅参与了细胞的增殖，也参与了抑制细胞的凋亡。Malik等[15]也曾提出RAGE基因可以通过激活细胞周期蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2及自噬相关蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的凋亡，从而提高肿瘤细胞的存活率。本研究发现RAGE具有促进宫颈癌细胞凋亡的能力，且该作用与抗凋亡蛋白Bcl-2相关，而与Bax和Bim无关。