卵巢癌细胞表面特异性结合肽的筛选及鉴定

李文桔 王乐丹 赵宇

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，虽然发病率低于宫颈癌及子宫内膜癌，但由于早期诊断困难，70%～80%的患者发现时已为中晚期，治疗效果亦不理想，病死率已居妇科恶性肿瘤首位[1]。目前临床上用于诊断及监测卵巢癌及肿瘤治疗后复发的肿瘤标志物主要为CA125，但50%～60%的Ⅰ期卵巢癌患者 CA125水平并未升高[2]。此外，CA125水平升高也见于月经期、孕早期、子宫内膜异位症、卵巢良性肿瘤或其他一些恶性肿瘤。因此，临床上需要阳性预测值更高的肿瘤指标用于早期发现卵巢癌。目前由Smith等[3]创建的噬菌体展示技术被认为是筛选肿瘤细胞表面特异性结合肽的强有力、高通量的一种生物学技术[4]。该技术以噬菌体为载体，将外源基因插入噬菌体的基因组中，从而使其表达的外源多肽或蛋白与噬菌体衣壳蛋白以融合的形式展示在噬菌体表面，展示的外源多肽或蛋白并不影响噬菌体自身结构及功能，而且可以保持相对独立的空间结构及生物学活性。本研究利用噬菌体随机七肽库筛选卵巢癌细胞HO-8910表面特异性结合肽，以期为卵巢癌的早期诊断提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 卵巢癌细胞株HO-8910购自上海拜力生物科技有限公司，胰腺癌细胞株PANC-1和卵巢癌细胞株SKOV3均购自中国科学院上海细胞研究所细胞库，文库滴度为2×1013pfu/ml的噬菌体随机七肽库购自美国New England Biolabs公司，抗M13单抗和HRP-抗M13单抗均购自美国GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体生物淘洗 消化、收集细胞株HO-8910，重悬于含1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM无血清培养液，调整细胞数为1×107/ml；加入噬菌体随机七肽库10μl于4℃共同孵育2h；将混悬液与事先配置的有机分离液200μl（邻苯二甲酸二丁酯与环己烷组成，体积比为9∶1，密度为1.03g/ml)混合，低温离心机10 000g离心10min；转移EP管底的沉淀物至200μl的处于对数生长期的ER2738大肠杆菌菌液，细菌培养箱孵育30min，而后测滴度、扩增、纯化，进入下一轮淘洗，计数每一轮淘洗后和扩增后的噬菌体数目，计算回收率，如此重复3个循环。

1.2.2 ELISA法检测细胞株HO-8910与唑菌体单克隆的亲和力 96孔板内加入含104/孔的HO-8910细胞悬液，固定20min；封闭液（含1%BSA）封闭1h；分别加入在第3轮淘洗后获得的21个噬菌体单克隆（1.0×1010pfu/孔），设定PBS和M13K07为阴性对照，细菌培养箱里孵育 2h；加入 HRP-抗 M13 单抗（1∶6 000）共同孵育2h；TMB显色液显色，微板阅读器设置在405nm，如果随机克隆的OD值＞2.1倍的阴性对照克隆的OD值，即P/N值＞2.1，就表示此克隆对细胞有高亲和力。

1.2.3 噬菌体DNA测序 根据ELISA结果，选取其中亲和性较高的17个噬菌体，提取噬菌体DNA，通过基因序列推导出多肽序列，计算重复噬菌体数量。

1.2.4 噬菌体结合实验 分别收集细胞数为1×107/ml的HO-8910、PANC-1、SKOV3细胞悬浮液；分别加入10μl噬菌体MRMTIIN与这3种细胞低温孵育2h；离心、复苏、测滴度，计算不同细胞噬菌体结合率（洗脱后的噬菌体滴度/淘洗加入噬菌体滴度）。

1.2.5 免疫细胞染色 分别将细胞株HO-8910、PANC-1、SKOV3以每孔1.0×104/ml接种于细胞爬片上，多聚甲醛固定15min；BSA封闭20min；分别加入噬菌体MRMTIIN和 M13K07噬菌体（1.0×1010pfu/孔），37℃共同孵育2h，PBS为阴性对照；滴加1∶100倍比稀释的HRP-抗M13单抗孵育2h；将细胞爬片取出后置于载玻片上，在显微镜下滴加DAB显色液观察细胞显色情况，后苏木素染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜下拍片存档，细胞上有棕黄色颗粒提示阳性。

1.2.6 免疫荧光染色 分别将细胞株HO-8910、PANC-1、SKOV3接种于载玻片上，步骤同免疫细胞染色，加入1∶100倍比稀释的抗M13抗体共同孵育2h；加入荧光标记的兔抗鼠IgG（1∶300）于37℃共同孵育0.5h；1∶5 000的DAPI染细胞核，荧光显微镜下立即观察显色情况。

1.2.7 竞争抑制实验 不同稀释梯度的多肽MRMTIIN或对照肽RMTIINM与HO-8910细胞悬液低温孵育0.5h，再加入1.0×109pfu的噬菌体MRMTIIN低温孵育2h；随后步骤同噬菌体结合实验，多肽浓度最高为500μmol/L，最低为 0.01μmol/L，以 10 倍比逐渐稀释，总共有6个稀释度，其中多肽浓度为0μmol/L时，噬菌体滴度为100%，实验组共有7组，多肽浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、500μmol/L，观察相同浓度不同多肽的菌斑数量。

2 结果

2.1 阳性噬菌体的富集 本实验利用噬菌体随机七肽库对卵巢癌HO-8910细胞进行全细胞筛选，计算每轮回收率。结果显示第3轮回收率为4.6×10-4，与第1轮相比增加了306倍，由此提示噬菌体得到有效的富集，见表1。

表1 噬菌体七肽库筛选卵巢癌细胞株表面特异性多肽

2.2 阳性噬菌体亲和力鉴定 随机挑选第3轮淘洗后平板中获得的21个噬菌体单克隆进行ELISA实验，结果显示有17个噬菌体P/N值均＞2.1，见图1。

图1 ELISA法检测细胞株HO-8910与噬菌体单克隆的亲和力

2.3 DNA序列测定 选择ELISA试验中P/N值高的17个噬菌体单克隆进行DNA序列测定，结果显示17个噬菌体单克隆中有9种不同噬菌体，其中展示Met-Arg-Met-Thr-Ile-Ile-Asn（MRMTIIN）序列的噬菌体有7个，出现频率最高，见表2。

表2 噬菌体单克隆的序列分析及多肽序列

2.4 阳性噬菌体特异性鉴定

2.4.1 噬菌体结合实验 噬菌体MRMTIIN与细胞株HO-8910结合率最高，提示噬菌体MRMTIIN与HO-8910有较高的亲和力和特异性，见表3和图2。

表3 噬菌体MRMTIIN与不同细胞的结合实验

2.4.2 免疫细胞染色 HO-8910细胞表面可见棕黄色颗粒，说明噬菌体MRMTIIN能与HO-8910细胞结合（图3a，见插页），而PANC-1、SKOV3细胞表面未见棕黄色颗粒，说明噬菌体MRMTIIN不能与PANC-1细胞（图3b，见插页）和SKOV3细胞（图3c，见插页）结合；而对照组所有细胞均未见棕黄色颗粒，说明对照噬菌体M13K07均不与这3种细胞结合（图3d-f，见插页）。

图2 噬菌体MRMTIIN与不同细胞的结合实验

2.4.3 免疫荧光染色 HO-8910细胞表面可见绿色荧光提示噬菌体MRMTIIN能与HO-8910细胞结合，故免疫荧光染色结果与免疫细胞染色结果一致。噬菌体MRMTIIN选择性与HO-8910细胞结合（图4a，见插页），而与PANC-1细胞（图4b，见插页）和SKOV3细胞（图4c，见插页）均不结合，而对照噬菌体M13K07则均不与这3种细胞结合（图4d-f，见插页）。

2.4.4 竞争抑制实验 随着合成多肽浓度逐渐增加，噬菌体数量逐渐减少；而含有相同氨基酸但排列顺序不同的对照肽RMTIINM，随着浓度逐渐增加，噬菌体数量未见明显改变，说明多肽MRMTIIN能有效抑制噬菌体MRMTIIN与卵巢癌细胞株HO-8910的结合，见图5-6。

图5 合成多肽对噬菌体MRMTIIN与细胞HO-8910结合的抑制作用

3 讨论

图6 合成多肽对噬菌体MRMTIIN与细胞HO-8910结合的抑制作用

噬菌体展示技术[5]是以改造的噬菌体为载体，将外源多肽或蛋白质的基因插入噬菌体的基因组中，插入的外源基因并不影响噬菌体自身结构及功能，随着子代噬菌体的重新组装，插入的外源多肽继而以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；将改造的噬菌体与靶分子共同孵育一段时间，通过离心等方法洗去未结合及亲和性较弱的噬菌体，然后让亲和性较高的噬菌体从靶分子中洗脱下来进行扩增，经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”，阳性噬菌体就能得到高度富集；通过基因序列测定分析，进而推导出相应多肽的结构和功能，因此，预先不需要知道目标分子的结构信息。目前各项实验技术中能实现基因型和表型统一的就只有噬菌体展示技术[6]。经过20多年的发展，噬菌体展示技术已被广泛应用于单克隆抗体制备、肿瘤抗原筛选、生物疫苗、药物研制等[7-8]方面。

利用噬菌体展示技术能够快速、准确地发现与肿瘤细胞表面特异性结合的小分子多肽[9]。国内外利用噬菌体展示技术在体外已成功筛选出各种抗肿瘤短肽，如膀胱癌[10]、肺癌[11]结肠癌细胞[12]、乳腺癌细胞[13]等，这些小分子多肽可能在肿瘤的早期诊断、肿瘤转移侵袭、肿瘤靶向治疗等方面有潜在的临床应用价值。而目前国内外针对抗卵巢癌短肽的研究只有少数报道。王世宣等[14]利用噬菌体随机十二肽库，对卵巢癌细胞株A2780进行4轮生物淘洗，获得抗肿瘤短肽YYGLAEVDAGGS。Zhang等[15]利用噬菌体随机十二肽库，对卵巢癌细胞SKOV3进行3轮生物淘洗，从而获得卵巢癌细胞表面特异性结合肽SVSVGMKPSPRP，推测能成为卵巢癌靶向治疗的配体肽段。

本研究以上皮性卵巢癌细胞株HO-8910为靶细胞，利用噬菌体展示技术，经过3轮生物淘洗，回收率从1.5×10-6增加至4.6×10-4，第3轮的回收率与第1轮相比增加了306倍，提示阳性噬菌体得到有效的富集。在ELISA试验中，选取P/N值高的17个噬菌体单克隆进行DNA测序，根据插入外源基因序列推导出相应的氨基酸序列，结果显示这17个噬菌体单克隆中含有9种不同噬菌体，其中展示Met-Arg-Met-Thr-Ile-Ile-Asn（MRMTIIN）序列的噬菌体有7个，出现频率最高。

为进一步鉴定筛选获得的噬菌体MRMTIIN与细胞株HO-8910结合的特异性，本研究随后进行噬菌体结合实验、免疫细胞染色、免疫荧光染色、竞争抑制实验。在噬菌体结合实验中，与PANC-1、SKOV3细胞株相比，噬菌体MRMTIIN与HO-8910细胞有较高的亲和力和特异性。免疫细胞染色和免疫荧光染色实验结果提示，HO-8910细胞表面可见棕黄色颗粒（绿色荧光信号），说明噬菌体MRMTIIN能与HO-8910细胞结合，而PANC-1、SKOV3细胞表面未见棕黄色颗粒（绿色荧光信号），说明噬菌体MRMTIIN不能与PANC-1细胞及SKOV3细胞结合，免疫细胞染色和免疫荧光结果相一致。竞争抑制实验结果提示，随着合成多肽浓度逐渐增加，噬菌体数量逐渐减少，而含有相同氨基酸但排列顺序不同的对照肽RMTIINM，随着浓度逐渐增加，噬菌体数量未见明显改变，说明合成多肽MRMTIIN能有效抑制噬菌体MRMTIIN与卵巢癌细胞株HO-8910的结合。

综上所述，利用噬菌体展示技术筛选出的卵巢癌细胞表面特异性结合肽MRMTIIN能选择性与HO-8910细胞结合，利用此多肽进行生物体内淘洗等实验，可能会成为上皮性卵巢癌早期诊断的检测指标。