乳腺癌组织中SKA2 mRNA和蛋白的表达水平及其与临床病理特征的相关性

黄蓉 夏朝霞 杨峂 任舟辉

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性的身心健康[1-2]。虽然乳腺癌的治疗取得了很大进展，但其发生及转移的分子机制仍不清楚，有待进一步研究。传统观点认为，纺锤体和动粒相关蛋白2（spindle and kinetochore associated protein 2，SKA2）是参与细胞有丝分裂的相关基因，其能维持有丝分裂中期赤道板的稳定和适时关闭纺锤体检测点，从而保证细胞顺利完成有丝分裂中期并进入后期[3]。研究发现SKA2基因及其蛋白表达与一些恶性肿瘤的发生、发展、生物学行为和预后有着密切关系[4-12]。本研究拟采用实时荧光定量PCR法和免疫织化染色法分别检测乳腺癌组织及癌旁组织中SKA2的表达情况，分析乳腺癌中SKA2表达水平与患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、组织学分级、病理分型、分子分型及淋巴结转移状况等临床病理特征的相关性，从而探讨SKA2的表达与乳腺癌发生、发展及转移的关系，为研究乳腺癌的发病和转移机制，判断预后提供参考。

1 材料和方法

1.1 标本 收集2015—2017年在宁波市第二医院乳腺外科行乳腺癌根治术后患者的石蜡包埋组织标本160例及新鲜冷冻乳腺癌、癌旁组织标本40对。160例患者均为女性，年龄 41～75（55.3±11.4）岁；肿瘤直径＜2cm 78例，2～5cm 55例，＞5cm 27例；非浸润性癌32例，浸润性癌128例；TNM分期：Ⅰ期48例，Ⅱ期40例，Ⅲ期64例，Ⅳ期8例；淋巴结转移106例，未转移54例。40对新鲜乳腺癌、癌旁组织标本保存于-80℃冰箱内，癌旁组织分别取自标本上切缘或下切缘。所有标本均经病理检查证实，由病理科医师阅片并记录TNM分期、组织学分级、病理分型、是否淋巴结转移等病理资料。所有患者术前均未接受放、化疗或内分泌治疗等任何抗肿瘤治疗。

1.2 实时荧光定量PCR法检测SKA2 mRNA表达水平 取出冻存的40对新鲜乳腺癌及癌旁组织标本，加入100μl裂解液研磨成匀浆状，置入1.5ml离心管中，以Trizol法抽提总RNA。通过逆转录试剂盒（美国Thermo公司，批号：00422714，规格：100rxns）进行逆转录反应，获得cDNA，-20℃保存备用。按试剂盒提供的条件进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：95℃10min，1个循环；95℃ 10s，60℃ 1min，45 个循环。总反应体积为10μl，包括 SYBR Green PCR Master Mix 5μl，正向引物0.25μl，反向引物 0.25μl，逆转录出的 DNA 模板 4.5μl。SKA2 正向引物：5′-CTGAAACTATGCTAAGTGGGGGAG-3′，反向引物：5′-TTCCAAACATCCTGACACTCAAAAG-3′；内参 GAPDH 正向引物：5′-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3′，反向引物：5′-GCATCACCCGGAGGAGAAAT-3′；引物序列由深圳华大基因公司设计合成。采用2-ΔΔCt计算SKA2 mRNA表达水平。根据计算公式将标准值设为1，＞1为高表达，＜1为低表达。

1.3 免疫组化染色法检测SKA2蛋白表达 160例女性乳腺癌石蜡标本行SKA2蛋白表达检测。实验严格按照免疫组化染色S-P试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：SNM504，规格：160张片）进行，组织切片常规脱蜡至水，阻断内源性过氧化物酶，放入EDTA抗原修复液，PBS冲洗，兔血清封闭，滴加兔抗人SKA2多克隆抗体（美国 Thermo公司，批号：PA5-63689，1∶1 000），4℃冰箱过夜，PBS冲洗，滴加二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1054，1∶2 000），PBS 冲洗，滴加DAB显色剂，复染，常规脱水、透明，封片，显微镜观察，以PBS代替一抗作为阴性对照。SKA2阳性信号呈棕褐色颗粒，主要定位于细胞核。参照许良中等[13]的免疫组化反应结果的判定标准，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判断结果。按阳性细胞百分比记分：＜5%为0分，5%～＜25%为1分，25%～＜50%为2分，50%～＜75%为3分，≥75%为4分；按阳性细胞着色强度记分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。最后两者乘积：其中＜6分为低表达；≥6分为高表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验；等级资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织中SKA2 mRNA表达水平比较 乳腺癌组织中SKA2 mRNA表达水平为2.46±2.42，明显高于癌旁组织的1.10±0.46，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。SKA2 mRNA在乳腺癌中的高表达率为 70.0%（28/40），见图 2。

图1 乳腺癌组织及癌旁组织中SKA2 mRNA表达水平比较

图2 乳腺癌组织中SKA2 mRNA表达水平

2.2 乳腺癌组织中SKA2蛋白表达水平比较 乳腺癌组织中SKA2的阳性表达在镜下主要出现在细胞核中，为棕褐色颗粒。Ⅲ期+Ⅳ期患者SKA2蛋白表达水平为21.75± 2.87，显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者的 10.00±1.63，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 3。

图3 不同TNM分期乳腺癌组织中SKA2蛋白表达水平比较

2.3 SKA2蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系SKA2蛋白表达与患者TNM分期和淋巴结是否转移均有关（均P＜0.01），而与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、病理分型、分子分型均无关（均P＞0.05），见表1。

表1 SKA2蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

乳腺癌是一类生物特征各异的疾病，乳腺癌的发生、发展是由多基因、多阶段协同作用的结果[14]。传统的乳腺癌治疗方案普遍存在术后容易复发、晚期患者生存率低、化疗或内分泌耐药等问题[15]。随着分子生物学的快速发展，分子指标的靶向治疗成了目前的研究热点之一。

SKA2是2006年首次发现的参与组成纺锤体与动粒相关复合物的重要蛋白质。其通过与SKA1、SKA3结合，形成SKA复合体，进而使纺锤体的微管稳定地附着在染色体的动粒上，确保有丝分裂中期染色体排列到赤道面上形成赤道；调节纺锤体组装检测点，从而保证染色体正确的分配到子细胞中[16-17]。近年研究发现，SKA2与肿瘤密切相关。继Rice等[4]2008年首次发现SKA2在肺癌中显著性高表达，并对肺癌细胞的增殖起着非常重要的作用后，其他国内外学者也陆续发现SKA2在肺癌[5-6]、肾癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]、胶质瘤[10]、骨肉瘤[11-12]中扮演着癌基因的角色，并通过不同的调控机制，参与细胞的增殖与凋亡；且SKA2的表达与肿瘤患者的预后密切相关。然而SKA2在乳腺癌中的研究甚少。

本实验发现，新鲜乳腺癌组织中SKA2 mRNA表达水平显著高于癌旁组织，SKA2在乳腺癌中的高表达率为70.0%；160例乳腺癌石蜡标本中，SKA2蛋白表达与患者TNM分期和淋巴结是否转移均有关，而与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、病理分型、分子分型均无关，与Shi等[18]报道相似，说明SKA2蛋白表达与乳腺癌的临床分期和淋巴转移密切相关。本实验证明SKA2基因表达是反映乳腺癌发生、发展、生物学行为和预后的重要生物学标志物之一。

目前，对SKA2的研究主要集中于人类多种恶性肿瘤中的表达及细胞学功能影响，其在肿瘤中的分子作用机制，特别是对其上下游调节分子的鉴定，依然有待进一步深入研究。因此，深入研究SKA2在恶性肿瘤中的作用机制，将为以SKA2为靶点的肿瘤靶向治疗提供实验依据。