鸡内金及其混淆品的电泳图谱鉴定

张晓薇

（山西中医药大学，山西晋中030619）

鸡内金为常用中药，雉科动物家鸡（Calus galus darnestieus Brisson）的干燥沙囊内壁，始载于《神农本草经》［1］。含胃蛋白酶，淀粉酶，类角蛋白及谷氨酸，精氨酸，缬氨酸等18种氨基酸，黄色色素［2］。并含维生素B1，维生素B2，尼克酸，抗坏血酸及铝、钙、铁、镁、铜、锌等无机元素。本品性平，味甘。具健胃消食、涩精止遗之功效［3］。此外还有学者报道鸡内金具有降脂、抗凝等作用［4］，从古至今一直是临床的常用药，价格比较便宜。由于鸡内金的临床需求量较大，目前市场上鸡内金中掺伪、混淆现象较为严重。伪品是以腐竹、淀粉或豆制品类经加工压制后染色而成的薄片、细砂、食盐等常见，这些伪品通过性状可以简单鉴别。混淆品为鸭、鹅、鸽子沙囊内壁混作鸡内金用，鸡内金为不规则卷片，表面黄色、黄绿色或黄褐色，薄而半透明，具明显的条状皱纹，质脆，易碎。鸭内金性状呈类圆形碟片状，似鸡内金但较厚，呈黑绿色或紫黑色，稍有皱纹。造假者多采用硫磺熏白，或用漂白剂漂白，或用黄色颜料染色后混入鸡内金中［5］，二者混合起来通常性状不易鉴别。如果使用这种产品会严重影响药品质量和临床治疗效果。另外鸡的饲养方法很多，因产地、生长环境和取内金的阶段不同，其成分及含量相差很大。目前缺少鸡内金的鉴别标准，市场上大部分是靠性状来进行鉴别，但鉴别的精确度比较差。曲萌等［6］通过DNA分子标记方法进行鸡内金的鉴别，但在一般实验室难以实现。本实验过SDS-PAGE，对其所含蛋白质进行分离分析，利用蛋白质在等电点、分子量上的差异，达到简单方便鉴别鸡内金的目的，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 实验仪器 DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂），DYCZ-24D型双垂直电泳槽（北京市六一仪器厂），离心机（北京医用离心机厂），数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），电子天平，架盘天平（天津市天马仪器厂），数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），微量移液器，培养皿（直径120 mm），长头的滴管，容量瓶，刻度吸管，吸耳球，烧杯。

1.1.2 实验材料 母鸡内金，公鸡内金，小鸡内金，鸭内金，鸽子内金，均购置农贸市场当场宰割的动物。

1.1.3 实验药品 甘氨酸，丙烯酰胺（Acr），过硫酸铵（AP），β-巯基乙醇，三氯乙酸，N，N 亚甲基双丙烯酰胺（Bis），冰醋酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris），甲醇，盐酸，乙醇，四甲基乙二胺（TEMED，生化试剂），考马斯亮蓝R-250（染色剂），溴酚蓝（指示剂）以上试剂均为分析纯。十二烷基磺酸钠（SDS）（sigma科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂的配制

1.2.1.1 电泳缓冲液（pH 8.3） Tris 6.0 g，甘氨酸28.8 g，SDS 1 g加蒸馏水溶解，定容至1000 mL。置冰箱4℃保存，备用。用前稀释5倍。

1.2.1.2 上样缓冲液 1 M Tris-HCl（pH 6.8）2.0mL，β-巯基乙醇 1.0 mL，10%SDS 4.0 mL，甘油 2.0 mL，加蒸馏水至10 mL，置冰箱4℃保存，备用。

1.2.1.3 10%过硫酸铵 取0.1 g过硫酸铵加蒸馏水10 mL（用前配置）。

1.2.1.4 考马斯亮蓝染色液 0.25%（W/V），0.25 g考马斯亮蓝R-250，甲醇45 mL，冰醋酸 9.0 mL，蒸馏水45 mL，混匀使溶解。

1.2.1.5 脱色液 甲醇、冰醋酸、蒸馏水以3∶1∶6配制而成。

1.2.2 样品的制备 取实验材料1 g（预先研成粉末），加电泳缓冲液5 mL，超声提取40 min，移至离心管中，按3 000 r/min离心30 min，静置30 min，取上清液2 mL，加入等量上样缓冲液，在100℃沸水中加热5 min，以除去亚稳态聚合，加入0.05%溴酚蓝示踪剂100 μL，混匀备用。

1.2.3 凝胶的制备 参照文献［7］配制12%分离胶及5%浓缩胶。用制胶模具制备。

1.2.4 加样 用微量移液器分别吸取30 μL样品提取液，缓缓注入样品槽底部，样品上加在入5 μL溴酚蓝指示剂。

1.2.5 电泳 先进行预电泳，不加样品（I=30 mA，t=40 min）；预电泳结束后，加样，开始时在浓缩胶先恒流30 mA，电泳约40 min。待样品进入分离胶后，改为恒流40 mA，电泳约5 h 45 min，当溴酚蓝示踪剂前沿距硅胶框底边0.5 cm时，停止电泳，关闭电源。然后拔掉楔形板，取下制胶扳。

1.2.6 染色、脱色 取出胶板，放入考马斯亮蓝R-250染色液中，在室温下染色4～6 h，用蒸馏水冲去凝胶表面附着染料，再用脱色液脱色，反复更换脱色液至谱带背景清晰为止。

2 结 果

不同实验材料电泳结果见图1～图3。图1，1～4条为母鸡，5～8条为公鸡。图2，1～4条为母鸡，5～8 条为小鸡。图 3，1～3 鸡内金，4～6 为鸭内金，7～9为鸽子内金。

图1 不同性别的鸡内金SDS-PAGE图谱

图2 不同生长阶段的鸡内金SDS-PAGE图谱

图3 鸡内金，鸭内金和鸽子内金SDS-PAGE图谱

3 讨论

3.1 不同性别鸡内金的电泳图谱比较

鸡内金的蛋白含量多少直接决定了该味药的品质。由图1可见不同性别的鸡内金蛋白质SDSPAGE电泳谱带有很大的相似性，但也存在一定的差异。A区由上至下可以看到母鸡内金较公鸡内金多一条较浅的谱带，且母鸡内金颜色也较公鸡内金深。B区从谱带的数目，颜色深浅，母鸡和公鸡都大致相同。C区大体相同，只是母鸡的蛋白质含量略高一点。

3.2 不同生长阶段的鸡内金电泳图谱比较

由图2可见，母鸡和小鸡内金的蛋白谱带有很大的区别。A区母鸡还有较浅的谱带，而小鸡几乎没有；B区母鸡内金有比较清晰的谱带，而小鸡的却不太明显。说明该区母鸡蛋白含量明显比小鸡多。C区母鸡内金的谱带数目也明显比小鸡的多，且谱带也比小鸡的清晰。鸡内金具健胃消食、涩精止遗之功效。未达到取内金生长阶段的鸡内金，由于缺少某些有效成分，其临床功效有很大差异。

3.3 鸡内金、鸭内金、鸽子内金的比较

由图3观察鸡内金、鸭内金及鸽子内金的谱带都有一定的差异。A区鸡内金的谱带最多，也最清楚。而鸭内金的有些谱带缺少，鸽子内金的谱带位置与鸡内金比有一些差别。B区三者谱带位置一致，大约都有三条谱带，但鸽子内金的谱带分离的更清楚，鸡内金谱带清楚的只有二条。C区三者有明显的区别，其中鸡内金的最清楚。

通过以上实验可以看出母鸡和公鸡内金蛋白区别不大，作为一味中药，公鸡和母鸡鸡内金应该都能入药，对临床药效影响不大；不同生长时期鸡内金、蛋白质图谱之间存在较大的差异。说明不同阶段的鸡内金有效成分相差较大，临床应该用成熟的鸡内金入药。这也为目前临床上使用鸡内金提供了一项可行的鉴定依据。不同物种鸡内金、鸭内金及鸽子内金所得SDS-PAGE图谱存在明显不同，所以临床上不应混用，以免影响临床疗效。鸡内金与混淆品外观极其相似，购买时易混淆，沈琴华［8］用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行过分析，但手段略显落后，使用SDS-PAGE进行分析能更高效清楚的表现各种物质的蛋白质差别，为鸡内金的鉴别提供可行的质量评价标准。

陆维承等［9］报道鸡内金水煮比传统工艺砂炒的淀粉酶活力要强，而本实验对样品处理进行了方法学比较。实验证明超声处理，图谱条带更为清晰，所得蛋白含量比传统水煮高，因为超声处理后，液体呈糊状，极大的促进了鸡内金与酶的接触，加速了水解，促进酶解速度，提取效率明显增高，为金内经的提取工艺提出了新的方法。