急性脑梗死的血浆代谢标志物研究

李 深， 徐桂莲， 张兴哲， 孙正武， 储成艳， 耿 欣， 高 鹏， 蓝晓艳

脑梗死是世界范围内成人致死和致残的主要原因[1,2]。其中，缺血性脑梗死是由于脑动脉的狭窄或闭塞造成脑组织的缺血坏死，占所有脑梗死的70%以上[3]。快速可靠的脑梗死诊断对于优化临床治疗、改善患者预后具有积极作用。目前CT和MRI等影像学方法已被广泛用于脑梗死的诊断，但其有操作复杂、需搬动患者、花费大等弊端，寻找对脑梗死诊断和病情演变具有指示作用的血液生物学标记物具有重要意义。

代谢组学高通量地研究体液或组织的全部代谢产物，可用于分析疾病的发病机制，也可用于筛选疾病的生物标志物[4]。目前已有多个针对脑梗死患者的代谢组学研究[5～9]，但这些研究均只比较了脑梗死患者和健康对照者的代谢组学差异，没有设置其他神经系统疾病对照组，降低了其结果的特异性。本研究通过多元统计分析比较脑梗死患者、其他神经系统疾病患者和健康对照者血浆代谢物的差异，并利用受试者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线检验了筛选得到的潜在生物标志物对脑梗死的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 十三烷酸、甲醇、甲氧胺吡啶、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)购自美国Sigma公司。美国Labconco公司真空冷冻干燥机；美国BD公司EDTA真空抗凝管；德国Eppendorf公司低温高速离心机；美国Agilent Technologies公司GC-MS代谢组学分析仪。

1.2 临床患者入组 连续收集自2017年1月1日-2017年5月31日于大连市中心医院住院治疗的急性脑梗死患者(S组，n=33)、其他神经系统疾病患者(DC组，n=40)和来院体检的健康对照者(HC组，n=35)血浆。脑梗死的纳入标准为：(1)急性神经功能缺损症状出现小于7 d；(2)核磁共振弥散加权成像确定为新发脑梗死；(3)美国国立卫生研究院卒中量表评分≥4分。为增加代谢组学筛选的特异性。本研究还纳入了一组除急性脑血管病外其他神经系统疾病对照组(包括8例帕金森氏病、6例阿尔兹海默病、5例急性面神经炎、5例癫痫、4例多发性硬化、3例颅内肿瘤、3例急性脊髓炎、3例格林巴利综合征、2例运动神经元病、1例梅杰综合征)。两组的排除标准均为：(1)存在出血、感染、创伤、昏迷或任何其他并发症；(2)肾、肝功能不全、心力衰竭、呼吸衰竭或任何其他器官功能不全；(3)怀孕或月经期；(4)近期接受手术治疗(2 w内)；(5)急性心肌梗死(3月内)。研究方案经大连市中心医院伦理委员会审查和批准(编号2017-010-20)，所有参与实验的对象均签署书面知情同意书。

1.3 样品准备 清晨空腹采血，离心5 min(3000 rpm,4 ℃)，收集上清于冰上将50 μl血浆加入至200 μl含20 μg/ml十三烷酸(内标)的冰冷甲醇中，离心10 min沉淀蛋白(12,000 g,4 ℃)。收集上清，通过Labconco真空冷冻干燥机真空干燥和浓缩上清。以甲氧胺吡啶溶液(50 μl,20 mg/ml)再次溶解干燥的上清物，40 ℃水浴90 min。随后，加入40 μl的N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺进行三甲硅烷基化作用60 min至代谢组学分析。

1.4 气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)代谢组学分析 参照报道的方法进行GC-MS代谢组学分析[10]。采用Agilent7890/5975C GC-MS仪采集血浆样品的代谢组谱。将1 μl处理的样品以10∶1分流比例注入至Da B-5融合石英的毛细管柱(30×0.25 mm×0.25 μm)。热循环程序设置如下：初始气相色谱箱温度设为70 ℃，维持3 min，然后以5 ℃/min的速度升至300 ℃，维持5 min。样品注入温度为300 ℃，输送管道温度为280 ℃。高纯度氦(99.9996%)用作运载气体，恒定流速为1.2 ml/min。质谱以2光谱/秒的扫描速度获得，质量扫描范围设定为m/z 33-600。

2 结 果

2.1 组间一般资料 临床信息和血液生化检验的比较 入组急性脑梗死患者的一般资料(见表1)。对3组间的性别、年龄、吸烟及饮酒史、体重指数、糖尿病、高血压、血脂、血同型半胱氨酸和尿酸水平进行比较发现糖尿病和高血压患病率在S组较在DC组高。糖化血红蛋白和血糖在S组较DC组及HC组高。血肌酐、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇在S组和DC组间无显著差异。

2.2 急性脑梗死患者的代谢组改变 代谢组学筛选显示了各组间VIP>1的共137种代谢物，包括含氮化合物、脂肪酸及其衍生物以及单糖类及其衍生物等。其中，有37种代谢物在任意两组间有显著统计学差异(见表2)。在S和HC组之间、S与DC组之间以及DC与HC组之间分别有26种、16种和23种显著变化的代谢物。有12种代谢物在S组与DC组之间以及S组与HC组之间呈同向性显著性差异：葡萄糖、阿拉伯呋喃糖、丁酸、甘露糖、古洛糖、异丙基1β-D-硫代半乳糖苷、呋喃半乳糖苷、棕榈酸(在S组显著增高);2-哌啶甲酸、焦谷氨酸和1,5-无水-D-山梨醇(在S组显著下降)。这些代谢物参与糖代谢、氨基酸代谢或脂肪酸代谢。

2.3 异常调节的代谢物作为脑梗死诊断的可行性评价 在上述显著变化的12种代谢物中，有8种与糖代谢有关，因脑梗死组较对照组的糖尿病患者多，他们可能对脑梗死不具有特异性。因而，我们仅进一步分析了2-哌啶甲酸、焦谷氨酸、丁酸和棕榈酸这4种代谢物对于脑梗死的诊断价值。ROC曲线分析显示它们用于诊断急性脑梗死的最佳界点值分别为：丁酸：0.931(敏感度81.8%，特异度80%)；2-哌啶甲酸：1.497(敏感度90.9%，特异度54.3%)；焦谷氨酸：1.391(敏感度93.9%，特异度45.7%)；棕榈酸：1.452(敏感度66.7%，特异度88.6%)。曲线下面积分别为：丁酸：0.826(95%可信区间为：0.726～0.926，P<0.05)；2-哌啶甲酸：0.737(95%可信区间为：0.619～0.855，P<0.05)；焦谷氨酸：0.729(95%可信区间为：0.610～0.848，P<0.05)；棕榈酸：0.727(95%可信区间为：0.594～0.860，P<0.05)。此外，为了排除糖尿病及血糖水平对这4种代谢物的影响，我们对样本中16例无糖尿病的脑梗死患者与健康对照组之间进行统计分析，结果显示丁酸、2-哌啶甲酸、焦谷氨酸和棕榈酸在两组间均有显著统计学差异(P<0.05)。

表1 代谢组学筛选个体的基本信息

S组与DC组相比**P<0.01；S组与HC组相比##P<0.01

表2 代谢组学筛选得到的各组间差异表达的代谢物

S组与DC组相比*P<0.05，**P<0.01；S组与HC组相比#P<0.05，##P<0.01；DC组与HC组相比△P<0.05，△△P<0.01,“-”代表两组间无差异

3 讨 论

传统的疾病研究一直是针对特定的基因、蛋白质和代谢产物[11]，并不足以理解复杂疾病的全貌，因为其他的、无靶向的和潜在未知的生物分子可能参与病理机制[5]。近年来，“组学”技术因其对生物分子的综合分析受到了广泛关注。代谢组学，作为基因组信息的复合表型之一，可能发现转录组学和蛋白质组学未能揭示的生物学现象[12]。现有的代谢组学研究显示乳酸、丙酮酸、乙醇酸、甲酸酯、F2-异前列腺素在脑梗死后增加，而谷氨酰胺和甲醇的含量下降[5,7,8]。然而，我们的研究结果表明乳酸和丙酮酸等在其他神经系统疾病患者血浆中的变化与脑梗死患者相同，因而对脑梗死并没有特异性。寻找高灵敏性和特异度的脑梗死生物标志物有可能为早期、快速、可靠诊断和准确评估病情提供有力帮助。

我们的结果发现焦谷氨酸、丁酸和2-哌啶甲酸对于脑梗死的诊断均具有较高的敏感度(分别为93.9%、81.8%和90.9%)，而棕榈酸具有较高的特异性(88.6%)。丁酸和棕榈酸是脂肪酸家族成员，其在脑梗死患者中含量的增加提示脂肪酸代谢的紊乱[13]。2-哌啶甲酸是赖氨酸代谢的产物[14]，参与纤维蛋白溶解过程。焦谷氨酸是谷胱甘肽生物合成中的重要分子[6,15]，脑梗死患者中焦谷氨酸的降低提示患者体内氧化应激造成的还原性物质减少。然而，焦谷氨酸和2-哌啶甲酸诊断缺血性脑梗死的特异性较低(分别为45.7%和54.3%)，可能与脑梗死过程中氧化应激以及赖氨酸代谢的广泛性、复杂性有关。

综上，我们对急性脑梗死患者的血浆代谢组进行了研究，创新性地加入了非脑梗死的神经系统疾病对照组，提高了脑梗死生物标志物筛选的特异性，其临床意义一旦确定，有助于开发更简易、便捷的诊断检测方法。然而，我们的结果仍有待更大规模、多中心的临床研究验证。此外，还需要进一步探索联合生物标记模式在早期识别脑梗死患者中的作用。