猪圆环病毒3型的检测及其全基因进化分析

2018-09-10葛菲菲鞠厚斌杨德全周锦萍

中国动物传染病学报 2018年4期

葛菲菲，李鑫，刘健，鞠厚斌，杨德全，王建，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是圆环病毒科、圆环病毒属的重要成员之一。该病毒包括2个基因型：1型和2型，即PCV1和PCV2[1]。PCV1是从猪肾上皮细胞（PK15）中分离出来的非致病性病毒粒子[2]，而PCV2则是目前对全世界养猪业危害极大的病原体之一，给全球养殖业带来了巨大的经济损失[3]。2015年6月，美国北卡罗来纳州一个商品猪场母猪群暴发皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）。发病期间，该场母猪死亡率较历史平均水平增加了10.2%，受胎率减少了0.6%，窝均木乃伊胎相比历史平均水平增加1.19%，流产出的木伊胎大小不一。针对样本采用宏基因组测序后，发现1种基因型不同以往的圆环病毒，命名为PCV3[4]。何启盖等[5]开展我国PCV3临床调查，发现PCV3与母猪繁殖障碍疾病相关联，在我国8个省及1个直辖市均有分布。对PCV3全基因组及部分基因组序列进化分析表明，我国PCV3包括2个亚群：3a及3b，其中3a和美国参考PCV3/USA/MO2015（GenBank登录号：KX778720.1）毒株处于同一分支，具有很近的同源进化关系。本研究选取了2016年3月～2017年3月在上海市规模化养殖场采集的商品肉猪20份病料，进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、猪乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）和猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）等病原体检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2016年3月～2017年3月年采集自上海市规模化养殖场的商品肉猪病料20份。

1.1.2 试剂核酸提取试剂盒为MagPure Viral RNA KIT；猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒荧光PCR试剂由北京生科尚仪科技有限公司提供；猪细小病毒、猪乙脑病毒荧光PCR试剂由广州维伯鑫生物科技有限公司提供。

1.2 病料核酸的提取称取25 mg病料组织，加入1 mL无菌PBS研磨，5000×g离心1 min，弃掉上清。总核酸的分离纯化按照磁珠法病毒RNA抽提试剂盒操作手册进行。

1.3 荧光PCR检测 PRRSV、PCV2、PRV、CSFV、PPV、JEV荧光PCR检测方法均按照试剂盒说明书进行。

1.4 PCV 3的检测引物设计参考文献[5]。

1.5 病毒分离对PCV3检测阳性样品进行病毒分离。将样品接种于长成单层的PK15细胞，吸附1～2 h，弃去液体，加入10 mL病毒维持液（DMEM+2%FBS），于37℃、5%CO2培养箱静置培养4～5 d，每天观察细胞变化。如无病变则于培养后的4～5 d收取上清，传代至第3代仍无病变判为阴性；如出现病变则冻融3次细胞收毒，-30℃保存备用。

1.6 基因cDNA核苷酸序列分析比较借助DNA Star4.0分析软件，通过Jotun Hein方法分析比较所得序列的同源性。

1.7 绘制系统发育树借助MEGA3.1分析软件，确定获得毒株基因的遗传进化情况。

2 结果

2.1 PCR检测结果 20份病料中只有1份病料PCR检测出PRRSV阳性，PCV2、PRV、CSFV、PPV、JEV均为阴性；2份病料呈PCV3阳性，其中1份为PCV3和PRRSV混合感染。这2份病料均为2016年7月采集，PCR检测结果见图1，产物大小与参考文献[3]报道一致，约为649 bp。全基因PCR扩增结果详见图2，产物大小与参考文献[5]报道一致，分别为1075 bp和1257 bp。

2.2 病毒分离对PCV3阳性样品在PK15细胞上进行了病毒分离，在PK15细胞上盲传至第3代后，经PCR鉴定未分离到PCV3。

图1 PCV3 PCR检测结果Fig.1 Detection result of PCV3 by PCR

图2 PCV3全基因PCR扩增结果Fig.2 Amplification of PCV3 whole genome by PCR

1: nt1120～2195 PCR扩增产物; 2: nt1～1257 PCR扩增产物; M:DNA 分子量标准(DL2000)1: nt1120-2195 PCR products; 2: nt1-1257 PCR products; M:DNA Marker(DL2000)

2.3 基因同源性以及进化关系分析将2份PCV3阳性样品分别命名为PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016（GenBank登录号：KY865242）和PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016（GenBank登录号：KY865243），他们与中国来源的PCV3分离株（全基因GenBank登录号：KY075986.1～KY075994.1、囊膜蛋白GenBank登录号：KY075995.1 ～KY076027.1）以及美国PCV3/USA/MO2015株（GenBank登录号：KX778720.1）的全基因以及囊膜蛋白的核苷酸同源性分别为98.8%～99.1%和97.5%～98.9%；本研究中的PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016、PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016株与中国来源的PCV3分离株全基因以及囊膜蛋白的核苷酸同源性分别为98.8%～100%和97.7%～100%。在全基因进化树中，中国来源的PCV3毒株和美国PCV3/USA/MO2015株在同一群中（图3A），在囊膜蛋白基因的进化树中，本研究中的PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016和PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016株属于PCV3a（图3B）。

3 讨论

本研究对2016年3月～2017年3月采集自上海市猪场20份病料进行病原体检测，在2016年7月采集的2份流产胎儿中检测到PCV3，这2份阳性样本来源于不同的规模化猪场。调查显示，这2个猪场的流产比例在3%左右，木乃伊比例从2016年2月份的1.9%上升到3.5%，其他生产情况无明显变化。说明PCV3可以发生垂直传播，即病毒可以通过胎盘感染孕期胎猪[6]。其中1份阳性样品为PCV3和PRRSV的混合感染。此外我们也尝试了使用PK15细胞进行了PCV3的分离，结果未成功分离到PCV3，这和Palinski等[7]报道一致，在第1代细胞中PCV3 PCR检测即为阴性，可能与样品前处理过程有关。研磨病料时，加含抗菌素的PBS制成体积分数为20%的组织悬液，离心取上清后，再用0.2μm滤器过滤，最后感作PK15细胞，加入维持液培养，这样的操作会导致病毒的稀释。

根据部分囊膜蛋白基因序列进行基因进化分析，本研究中的PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016和PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016株属于PCV3a。基因组全序列分析发现，PCV3基因组包含2 kb核苷酸，具有与PCV1和PCV2相似的基因组结构，主要编码Cap和Rep 2个蛋白。在cap和rep基因5'端包含有一个由9个碱基（TAGTATTAC）组成的茎环结构，其碱基组成与PCV1的茎环结构上的序列完全一致。PCV3 Cap有214个氨基酸残基，较PCV2 Cap少19～20个，此外，与PCV2和鸭圆环病毒相比，PCV3 cap基因相似性仅为36%～37%。PCV3 rep基因编码297个氨基酸残基，与GenBank数据库其他毒株比较发现，该Rep氨基酸与先前在美国报道的1株PCV毒株（GenBank登录号：ADU77001）具有较高的相似性（69.4%）；与我国分离到的蝙蝠圆环病毒的Rep相似性为54%。目前我们对于PCV3 的认识仍极为有限。展望未来，我们需要从以下几个方面加强对PCV3的研究和探索：分离到PCV3 毒株并建立起细胞培养体系；开展动物回归试验；对PCV3 进行基础的病原学研究。目前对PCV3 Cap结构及抗原性分析发现，PCV2和PCV3表现出很大的差异[8]，推测PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性。因此，针对PCV3进行新的疫苗研究和开发，对于将来控制PCV3流行是十分必要的。