面制品中氨基脲的测定及风险分析研究

樊继鹏　余秀娟　徐振东等

[摘要]建立一种测定面制品中品质改良剂偶氮二甲酰胺的降解产物——氨基脲（SEM）的液相色谱质谱联用LC-MS/MS法，将面制品通过低温冷冻干燥，研磨后选择乙酸乙酯做提取剂，40℃超声30min，采用ESI+正离子质谱电离模式，乙腈-0.3%乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，该方法y=0.046 8x+0.0117在1.0～100.0μg/kg范围内具有良好的线性特征，相关系数r=0.9998，检出限LOD=0.25 μg/kg，其样品加标回收率为81.2%～92.3%，相对标准偏差RSD为5.9%～6.8%，说明该方法可行。同时，从危害识别、暴露评估、风险描述等角度对面制品中SEM潜在安全风险进行分析。

[关键词]面制品；氨基脲；偶氮三甲酰胺；风险；液相色谱串联质谱法

中图分类号：TS211.7 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180210

SEM是一种与硝基呋喃类药物——呋喃西林代谢产物一致的化合物，具有致突变和致癌作用，常作为呋喃西林的代谢物在兽药残留中被检出。近年来，研究发现面粉制品所添加品质改良剂ADA经过湿润和热加工处理后发生降解产生SEM。我国农业部公告（560号）将呋喃西林及其盐、酯及制剂列入兽药名单。欧盟早已禁止使用ADA作为面粉处理剂，而我国GB 2760-2014食品添加剂使用标准规定小麦粉中ADA最大使用量为45mg/kg。

目前，国内对于SEM的测定一般采用液相色谱串联质谱法，并无面制品中SEM的检测标准，关于面粉熟食制品中呋喃西林代谢产物SEM的研究报道也比较少。因此，为更好解决面粉及制品中ADA与SEM间转化关系以及二者之间转化的数量关系，十分有必要建立一种面粉及其制品中SEM的检测方法。同时，针对SEM作为品质改良剂ADA在面制品中降解产物，因其致癌、致畸等危害性，对其食用过程中的安全性进行风险分析，以期为面制品行业的有效监管提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料与试剂

面粉（苏州市售）；丙酮（HPLC级）；正己烷（HPLC级）；乙酸铵（HPLC级）；ADA标准品；SEM标准品（Dr.Erenstorfer）；呋喃西林代谢物标记物¹³C，¹⁵N-SEM（内标）：Witega；甲醇，乙酸乙酯、乙腈、正己烷为色谱纯；盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、邻硝基苯甲醛均为分析纯；有机相滤膜（尼龙膜，0.22μm）。

1.2仪器与设备

AB 4500液相色谱质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；Organomation N-EVAP氮吹仪；IKA涡旋混合器；Milli-Q超纯水系统（苏州赛恩斯仪器有限公司）；（Hermle）Z 233M2微量高速型离心机（上海卡耐兹实验仪器设备有限公司）；HWS系列恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；Mettler-Toledo精密电子天平（梅特勒-托利多公司）；H2050R Cence高速离心机（湖南湘仪公司）；MM 400冷冻混合球磨仪（德国RETSCH公司）。

1.3试验方法

1.3.1样品处理

1.3.1.1面粉、生干性面制品

水解和衍生化：将样品粉碎混匀，称取5.0g（精确到0.001g）至50mL具塞比色管中，加入10mL0.2mol/L的盐酸溶液，10000r/min涡旋30s，加入适量的内标标准溶液和10mL 0.1mol/L的邻硝基苯甲醛-甲醇溶液，涡旋30s，40℃水浴中超声30min。取出样品冷却至室温，10000r/min离心5min，将上清液转移至另一离心管。

提取和净化：向上清液中加入5mL 0.1mol/L的K₂HPO₄，用1mol/L和0.1mol/L的NaOH溶液调节pH=7.5（±0.2）。加入10mL乙酸乙酯，涡旋振荡5min，6 000r/min离心5min，吸取上清液。10mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯层，45℃下氮吹浓缩至近干。在残留物中准确加入5mL 0.3%乙酸水-乙腈（7/3，V/V）溶液溶解，涡旋30s，加入3mL正己烷，超声1min，10000r/min离心5min，下层水相经0.22 μn微孔滤膜过滤后供仪器分析。

1.3.1.2生湿性面制品和发酵性面制品

该类样品先去馅后切细，经搅拌机绞碎、混匀，称取5.0g（精确到0.001g）至50mL具塞比色管中，剩余方法同1.3.1.1。

1.3.1.3其他类面制品

主要针对基质相对复杂、粘弹性大无法研磨充分的面制品，該类面制品后期提取过程中易造成提取不充分。取该类样品中的待测部分，先用冷冻干燥器干燥（称量干燥前后的样品质量），然后将干燥后样品粉碎混匀，称取5.0g至50mL具塞比色管中，剩余方法同1.3.1.1。

1.3.2色谱条件

1.3.2.1 ADA色谱条件

色谱柱：氰基CN柱4.6mm×250mm 5um，流动相等度洗脱：20.0mmol/L乙酸铵：乙腈=98：2，柱温：30℃，流速：0.8ml/min，检测波长：245nm，进样量：10μl。

1.3.2.2 SEM色谱条件

（1）色谱条件：色谱柱Waters，C₁₈，3.5μm×2.1μm×150mm；柱温30℃；流动相A为0.3%乙酸酸水溶液，流动相B为0.3%乙酸乙腈溶液；梯度洗脱0：00min，A90%-7：00min，A10%-9：00min，A10%-9：01min，A90%-10：00min，A90%；流速为0.2mL/min。

（2）质谱条件：电离源模式，电喷雾离子源（eleetrospmy ionization，ESI）；电离源极性：正模式（ESI+）；检测方式，多反应监测（multi-reactions monitoring，MRM）；电喷雾电压，5000V；雾化气压力，60.0psi；辅助气压力，60.0psi；气帘气压力35.0psi；干燥气温度，480℃；其他质谱参数如表1所示。

1.4实验内容

1.4.1条件的优化

参照1.3.1样品处理方法及1.3.2色谱条件，样品经加标后采用3水平6平行实验，进行检测分析，以确定分析条件的可行性。

1.4.2面制品中ADA其降解产物SEM安全风险分析

通过面制品中ADA的降解途径、ADA及其SEM的风险识别、安全风险评估、实际SEM的污染情况、暴露评估以及该类品质改良剂的风险管理建议及措施，对面制品中ADA其降解产物SEM安全风险进行分析。

1.4.3数据处理

各指标值测定均重复6次（n=6），用excel软件进行数据分析，用SAS 9.0软件进行Duncan新复极差分析。

2结果与分析

2.1方法线性范围和检出限

选择阴性样品，按照终浓度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/kg加入适量的标准溶液和样品进行相同的水解、衍生、提取、净化步骤，制备标准工作曲线。在阴性基质中进行加标实验，按信噪比3：1确定检出限，信噪比10：1确定定量限。待测液和标准品的选择离子峰保留时间一致（±0.5%），对应质谱碎片离子的质荷比与标准品一致，其豐度比与标准品相比应：相对丰度>50%时，允许±10%偏差；相对丰度20%～50%时，允许±15%偏差；相对丰度10%～20%时，允许±20%偏差；相对丰度≤10%时，允许±50%偏差，此时可定性确证目标分析物。SEM衍生物的线性方程、相关系数、线性范围及SEM的检出限数据如表2所示。

图1是在上述色谱条件下，2-NBA-SEM液相色谱串联质谱法标准曲线图，详细变化过程如图1所示。

图2是在上述色谱条件下，SEM和¹³C，¹⁵N-SEM标准物质的选择离子色谱图，详细对照图如图2所示。

2.2方法的回收率和精密度

选取市售面制熟食，参照1.3.1样品处理方法及1.3.2色谱条件，样品经加标后采用3水平6平行实验，通过不同浓度加标及重复性实验，回收率、精密度如表3所示。

由表3数据可知，通过基质加标，进行3水平6平行试验，所得SEM的加标回收率为81.2%、86.5%、92.3%，相对标准偏差小于6.8%，其检测结果符合GB/T27404-2008实验室质量控制规范中食品理化检验的要求。

2.3面制品中ADA其降解产物SEM安全风险分析

ADA的毒性为“一般认为安全”（GRAS），我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB 2760-2011）中规定：小麦粉中ADA的最大使用量为0.045g/kg。但研究表明，ADA在湿润、酸性等条件下能够迅速转变成联二脲（B1U），再经过蒸、烤等高温处理，BIU又能够转变成氨基脲（SEM）和尿唑（Urazole），而SEM是公认的致癌物。本研究通过阐释特定热加工条件对面制品中ADA及其降解产物进行风险识别、评估，并在前期动力学降解实验研究的基础上，核算ADA降解为SEM的转趋规律，从保障食品安全和食品贸易的角度提出风险管理建议。

2.3.1 ADA及其SEM的风险识别

从毒理学的角度来说，ADA为GRAS，小鼠口服LD50>10g/kg，日容许摄入量ADI为0～45mg/kg（FAO/WHO，1985），此范围内被认为无毒。

SEM的LD50为225 mg/kg，急性毒性表现为吸人染毒，皮肤接触、入眼都有危险，导致过敏、充血等；其慢性毒性表现为反复长期暴露在含有少量SEM的空气中，造成暴露部位的过敏反应，

SEM具有潜在的毒性及致癌、致畸性，主要表现出：具有一定程度的神经毒性，通过抑制谷氨酸脱羧酶（GAD），干扰神经信号传导，导致一些认知功能的缺失；对于不同类型的离体细胞均具遗传毒性；对动物组织器官均能产生多效性影响；在无细胞系统中，SEM能与RNA的胞嘧啶残留物、DNA的脱氧胞嘧啶残留物及胞嘧啶和脱氧胞嘧啶核苷连接，从而引起细胞染色体的损伤。可以看出，面包中ADA及其降解产物中造成食品安全风险的主要物质是SEM。

2.3.2 SEM安全风险评估

研究发现，影响面制品中ADA降解的主要因素是湿度和温度，通过模拟烘烤类面制品加工工艺，在面粉中添加ADA浓度为45 mg/kg，分别在和面15 min后（湿度为78%），温度为35℃发酵2.5 h，再在180℃下烘烤20 min过程中检测ADA和SEM含量，考察加工过程中ADA-SEM转趋规律，结果如表4所示。

由表4可知，经加工后，整体烘烤类面制品中ADA已基本降解，但在三种过程中实际测得SEM的平均含量仅分别为12.18、20.85、706.55ug/kg，ADA-SEM的转化率分别为0.04%、0.05%、1.57%。当按照ADA最大使用量（45mg/kg）添加时，降解产物SEM的含量已超过欧盟1.0μg/kg的最低检测灵敏度要求。

2.3.3 SEM的污染情况调查

分别从大型超市、面包店、食品杂货店和淘宝网店购买了20个面包样品，进行了SEM污染情况的调查，结果如表5所示。

由表5中可知，80个样品中有66个检出SEM，阳性率为82.5%，SEM含量在5.82～1058.250g/kg之间，平均值为166.95 μg/kg，与Becalski等的调查结果接近。可见，ADA作为面粉改性剂不同渠道销售的面包中普遍使用，导致市售面包中SEM污染。

2.3.4 ADA与SEMD暴露评估

ADA的ADI值为0～45mg/kg，60kg的成人日允许摄入量为0～270mg。成人若每日食用500g面包，按照我国GB 2760-2011标准规定，小麦粉中ADA最大使用量为45mg/kg，则日摄入ADA最多为22.5mg，在允日许摄入量范围之内，摄入ADA本身并不带来危害。由于ADA暴露于易感人群的途径是在面粉加工过程中，ADA粉末容易引起肺部和皮肤的急性过敏反应，吸入ADA粉末能导致哮喘和气急等疾病。因此，建议日常接触大量ADA的人员，在工作期间应佩戴过滤口罩、穿防护服作业。

ADA的降解产物SEM对公众的主要暴露途径是食用受其污染的食品。本研究中结果显示，45mg/kg ADA制作面包，整体面包样品中测得SEM的平均含量为706.55 μg/kg。按此计算，体重为60kg的成人若每日食用500g面包，则SEM的暴露量为5.88μgkg-bw/day，已超过EFSA规定的2g/kg-bw/day的“合理的最坏情况”。由此可见，按照45mg/kg的最大允许添加量添加ADA，产生SEM的量已可能危害公众健康，需要引起足够的重视。

2.3.5风险管理建议及措施

本研究结果及诸多文献报道均已证实面粉中添加ADA会降解产生危害物质SEM，并且按最大允许添加量（45mg/kg）添加ADA，产生SEM的量已超过EFSA的相关规定。从食品安全和确保消费者身体健康的角度，建议禁止继续使用ADA作为面粉添加剂。

本研究发现ADA降解为SEM的转化率1.57%计算，若要符合欧盟规定的SEM最低检测灵敏度要求（1.0μg/kg），ADA的使用量应控制在63.69μg/kg以内；若要符合日本“肯定列表制度”的最低检测灵敏度要求（0.5μg/kg），则ADA的使用量应控制在31.85μg/kg以内。按这种浓度水平添加，ADA已起不到添加剂作用。因此，从降低贸易纠紛的角度，也应该禁止在面粉中添加ADA。

ADA作为面粉添加剂仍然存在广泛争议，包括我国在内的一些国家仍然允许其使用。但考虑到在面粉加工过程产生降解产物（主要SEM）的危害性，本研究在测定方法的研究基础上，阐释了面包中ADA的降解途径和转化规律，对面包中的ADA及其降解产物进行了风险评估。同时从保障食品安全和食品贸易的角度，提出在面粉中禁止添加ADA的风险管理建议，以供相关产业链和相关管理机构参考。

3结论

（1）建立一种面粉及其制品中SEM的LC-MS/MS检测方法，针对面制品不同物性，采取了不同类预处理方式，采用衍生化和固液萃取及液液萃取法实现对SEM的检测，即选择乙酸乙酯做提取剂，40℃超声30min，采用ESI+正离子质谱电离模式，乙腈-0.3%乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，其目标物不仅达到完全分离而且峰形良好，保留时间合理。同时，通过实验验证，该方法y=0.046 8x+0.0117在1.0～100.0μg/kg范围内具有良好的线性特征，相关系数r=0.9998，检出限LOD=0.25μg/kg，其样品加标回收率为81.2%～92.3%，相对标准偏差RSD为5.9%～6.8%，该方法灵敏度高、精密度和准确度均符合要求，能够满足面粉及其制品中SEM的检测要求。

（2）针对面制品中品质改良剂ADA的降解产物SEM安全进行了分析研究，ADA在欧盟、澳大利亚、新加坡和日本和三聚氰胺、苏丹红一样都被列为非法添加物，而我国GB 2760-2014中规定：小麦粉中ADA的最大使用量为0.045g/kg。本研究通过模拟烘烤面制品制作工艺，考察其制作过程（和面、发酵）及烘烤过程各指标的转化情况，得到烘烤过程中ADA-SEM的转化率为1.57%，按我国ADA最大使用量添加时，降解产物SEM的含量已超过欧盟1.0μg/kg的最低检测灵敏度要求。结合抽样检测结果：对80个样品中有66个检出SEM，阳性率为82.5%，SEM含量在5.82～1058.25μg/kg，平均值为166.95μg/kg，由此可见，ADA作为面粉改性剂，在不同渠道销售的面包中普遍使用。同时，实验以45mg/kg ADA制作面包，整体面包样品中测得SEM的平均含量为706.55μg/kg。按此计算，体重为60kg的成人若每日食用500g面包，则SEM的暴露量为5.88μg/kg-bw/day，已超过EFSA规定的2g/kg-bw/day的“合理的最坏情况”。