左旋肉碱的分析方法

杨晓惠　郑侠　夏玉

[摘要]左旋肉碱是参与生物体新陈代谢的重要物质，具有多种生理功能，而左旋肉碱的含量是衡量其品质的重要指标。目前，各研究学者已经开发了多种分析方法对左旋肉碱的含量进行测定，主要包括酶技术法、高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法（IC）和质谱法（MS），但这些研究基本上都是实验性研究，缺少对于这些测定方法的归纳和总结。基于此，为了便于检验人员操作及选择，文章对近年来左旋肉碱的分析方法进行归纳总结，也为其他学者的进一步研究提供参考。

[关键词]左旋肉碱；测定方法；酶技术法；高效液相色谱法

中图分类号：Q55 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180207

左旋肉碱（L-carnitine），又称L-肉碱、左卡尼汀、L-肉毒碱或维生素BT，化学名为β-羟基γ-三甲铵丁酸，分子式为C₇H₁₅NO₃。是1905年由两位俄国科学家Gulewitsch和Krimberg在肌肉浸汁中发现的一种类维生素。

肉碱有左旋（L-广型）和右旋（D-型）两种异构体。其中只有L-型具有生理活性，而D-型是人工合成物，自然界中不存在，不仅没有生物活性，而且还对L-肉碱有竞争性抑制作用。通常肉碱所指都是左旋肉碱。

左旋肉碱的来源有两种：第一，体内合成（主要是肝脏和肾脏），第二，膳食摄取（主要是动物性食物）。其主要生理功能是作为载体将长链脂肪酸从线粒体膜外输送到膜内促进脂肪酸的β-氧化，从而促进机体脂肪代谢。此外，左旋肉碱还可以抗疲劳；缓解肾衰透析引起的急、慢性并发症；改善代谢综合征的腹部肥胖、血脂异常等临床症状；参与精子运动和成熟过程等。

根據上述生理功能，加之食用安全、性质稳定，近年来，左旋肉碱作为一种新型营养强化剂和功能食品原料在国内外得到了广泛的应用。包括减肥、健美等保健食品；婴儿食品营养强化剂；运动员、中老年人的营养补充剂、化妆品，此外，左旋肉碱在饲料和医疗药物方面也有应用。由此可见，左旋肉碱具有广阔的市场前景。

目前，左旋肉碱的检测方法主要有：酶技术法、高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法和质谱法，其中以酶显色法、酶荧光法和HPLC法较为常用。但关于左旋肉碱分析方法的研究主要是实验性的、缺少总结和分析性的综述文章，为了便于进一步研究，现将上述方法综述如下。

1酶技术法

酶技术法是目前测定左旋肉碱较为常用的方法，主要包括酶技术的分光光度法、放射酶法、自动分析仪法、荧光光度法、酶循环法等。

1.1分光光度法

（1）酶显色法。酶显色法也被称为2-硝基苯甲酸（DTNB）法，是目前测定左旋肉碱较为常用的方法。该方法最开始是由Marquis和Fritz于1964年建立，检测了小鼠组织中的游离肉碱，后经进一步完善成为现在的方法。该方法的机理为：左旋肉碱与乙酰辅酶A（乙酰CoA）在乙酰肉碱转移酶（CAT）的催化下反应生成乙酰肉碱和游离辅酶A（CoASH）。CoASH和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色物质，其颜色深浅与CoASH的含量成正比。因CoASH与左旋肉碱是等摩尔反应关系，通过分光光度法测定CoASH生成量即可间接测定左旋肉碱的含量。

该方法操作经济、快捷，且该方法中催化反应的CAT酶对于左旋肉碱和乙酰辅酶A之间的反应具有专一性，从而可以排除右旋肉碱的干扰，故灵敏度较高，检出限为0.6mg/100g，重复性和回收率较好，回收率在96.2%～104.7%之间。而且与化学法（通过比色法测定肉碱和溴酚蓝反应生成的有色物质来测定肉碱）相比，此法不受样品中所含季胺类物质的影响。国家标准《GB 29989婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》中使用的便是此方法。

该方法也有不足，由于DTNB还能与待测样品中其他的硫醇类（-SH）物质起反应，且DTNB与CoASH不能完全反应，从而影响测定的准确度。因此，为了消除SH物质的干扰，Marquis在测定前将样品置于90℃，pH8.5的环境中处理5min；也有人用H₂O₂氧化样品中含硫醇基的物质。

（2）2-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）法。Jochen Schafer和Heinz Reichmann（1989）对原方法进行改进，在测定游离辅酶A时用2-酮戊二酸取代DTNB，在2-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）催化下与CoASH反应，生产琥珀酰辅酶A和还原型辅酶I（NADH），NADH在340nm处有强吸收。与原方法相比，OGDH与CoASH反应的专一性更强，反应更加完全，且不受其他SH的影响。该方法灵敏度高至nmol级，肉碱回收率在103%～115%之间，适合低肉碱含量的样品。

1.2放射酶法

由于分光光度法敏感度较低，Cederblad和Lindstedt（1972）叫提出了用放射性同位素法来检测少量血清样品中皮摩尔级左旋肉碱的含量，其原理是将乙酰CoA用C14标记，即[C14]乙酰CoA+肉碱一[C14]乙酰肉碱+CoASH，将乙酰肉碱从乙酰CoA中分离出来，并测定肉碱的含量。由于可逆反应使反应不完全，导致只有加入超过量的乙酰CoA才能得到线性标准曲线。J.Denis Mc Garry和Daniel W.Foster（1976）对Cederblad和Lindstedt的方法进行了改进和简化，结果显示，不需要过量的标记乙酰CoA即可获得比较宽的线性范围；除此之外，即使在过量乙酰肉碱的存在下，也可以检测非常少量的肉碱。

1.3自动分析仪法

Lijun Wan和Richard W.Hubbard（1998）用全自动生化分析仪代替普通分光光度计，对血清中游离和结合的左旋肉碱进行测定。与原方法相比，使用全自动生化分析仪在1小时内即可完成检验，大大缩短了分析时间，而且可以降低人工操作及实验材料引起的分析成本。此方法不仅适用大型医院，也适用做临床研究的小型实验室。Gitten Cederblad等（1986）也曾用生物离心式分析仪对生物组织中的左旋肉碱进行测定。结果显示，与原分光光度法相比，该方法具有试剂成本低、操作简单、重现性好的优点，但与放射酶法相比，其灵敏度和精准度不如放射酶法，且在血浆、透析液、尿液和肌肉组织中的检测值比放射酶法偏高10%～25%。

1.4荧光光度法

Mitsuo Maehara等（1988）采用一种简单的荧光法对血清中游离肉碱进行测定，测定原理与分光光度法基本类似。肉碱与乙酰CoA在CAT的催化下反应生成乙酰肉碱和CoASH，CoASH与BIPM耦合生产强荧光物质CoA-BIPM，荧光强度与肉碱的含量成正比。通过测定荧光强度，可以得知血清中的肉碱含量。该方法的批内和批间变异系数（CV）分别为5.2%和2.6%，肉碱回收率在98%～113%之间。与显色法的测定结果相比具有良好的相关性（相关系数r>0.90）。该方法灵敏度较高，最低检测限为10 μmol/L。

Kojiro Matsumoto等（1990）开发了荧光流动注射法对丙戊酸治疗的患者血清中的肉碱进行测定。该方法使用了肉碱脱氢酶（CDH）和硫辛酰胺脱氢酶（DS）两种固定化酶催化两步反应，第一步是肉碱和氧化型辅酶I（NAD+）在CDH的催化下反应生成还原型辅酶I（NADH），第二步是NADH和刃天青（C12H7NO4）在DS的催化下反应生成荧光物质试卤灵（C12H7NO3、），试卤灵的荧光强度与肉碱的含量成正比。用该方法检测肉碱时，肉碱的标准曲线在0.1～1.0nmol范围内呈线性，检测的激发光波长和发射光波长分别为560nm和580nm。该方法适用于临床试验中对肉碱缺乏症的检测。

由于荧光法的测定结果容易受到样品中内源性荧光物质的影响，因此在测定过程中要对每一份样品设置空白。

1.5酶循环法

Mamoru Takahashi等（1994）开发了一种使用肉碱脱氢酶（CDH）测定血清中左旋肉碱的高灵敏度方法。该方法是一个还原型辅酶I（NADH）、硫代氧化型辅酶I（Thio-NAD+）和肉碱脱氢酶（CDH）共同参与的新型酶循环技术，原理是左旋肉碱在CDH和Thio-NAD+的存在下转化为脱氢肉碱，同时生成硫代还原型辅酶I（Thio-NADH），脱氢肉碱又在CDH和NADH的存在下转化为左旋肉碱，同时生成NAD+，此反应每循环一次，将生成与左旋肉碱等当量的Thio-NADH，因此在一定时间内，循环反应的次数便是Thio-NADH生成相当于左旋肉碱的倍数，通过测定Thio-NADH积累而引起415nm处的光吸收增量，即可得知左旋肉碱的含量，还可以提高左旋肉碱的n倍灵敏度。

用该方法测定血清中L-肉碱时，L-肉碱的标准曲线在5～250μmol/L范围内呈线性，回收率在96.5%～106%之间，批内与批间的变异系数（CV）分别为在0.66%～4.33%之间和1.02%～2.56%之间。该方法不受胆红素、血红蛋白、各种酯酰DL-肉碱和抗坏血酸盐的干扰，且操作过程简单、快速、精确、自动。

2高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法（HPLC）是近年来发展起来的先进方法，主要有酶联高效液相法、衍生高效液相法。

2.1酶联高效液相法

酶分光光度法的准确度较差，且由于乙酰CoA长时间在pH7.8条件下容易发生水解，故不适合肝脏组织的检测，Naoshi Takeyama等（1989）开发了酶联高效液相色谱法解决了上述问题。该方法采用高效液相色谱仪来检测左旋肉碱与乙酰CoA生成的CoASH，而不使用DTNB，平均检测1个样品时间为60min，灵敏度可达nmol级。

2.2衍生高效液相法

衍生法最开始是由Minkler等（1984）研究的反相离子对高效液相法，将肉碱衍生为4-bromophenaeyl ester，于254nm检测肉碱含量，肉碱检测结果在10～100nmol/mL范围内呈线性。为了避免衍生时生产的副产物影响测定结果，在样品预处理时应尽量去除其中的氯离子和多余的衍生剂。该方法的灵敏度适用于测定尿液中的肉碱，但不适用测定血浆中的肉碱，且不能区分开两个异构体L-型和D-型。

Ke Li等（2010）用衍生高效液相-紫外检测法对人血清中的游离肉碱和总肉碱进行测定，将肉碱衍生为酯，于260nm检测肉碱含量。该方法可同步测定血清中游离肉碱和总肉碱的含量。检测肉碱的线性范围为5～400μmol/L，批内游离肉碱和总肉碱的相对标准差分别为3.36%和1.97%；批间游離肉碱和总肉碱的相对标准差分别为3.34%和1.77%。游离肉碱和总肉碱的平均回收率分别为98.2%和96.3%。

国内赵亚明等（2006）建立了衍生高效液相色谱法检测血浆中左旋肉碱的方法。研究发现左旋肉碱经过衍生化处理后，在波长260nm处有一强的吸收波，说明衍生化反应可以提高左旋肉碱的检测灵敏度。该方法精密度RSD<4%、加样回收率>70%，稳定性良好，适用于临床血浆左旋肉碱浓度的监测。

李红艳等、（2013）研究了衍生高效液相色谱-荧光检测法测定乳制品中左旋肉碱含量的分析方法。左旋肉碱经提取后经L-丙酰胺-β-萘胺衍生后，于激发波长280nm、发射波长328nm下测定。该方法得到的乳粉检出限为4.0mg/kg、液体乳检出限为0.5mg/kg，检测的L-肉碱在0.2～20.0mg/L范围内呈线性，相关系数为0.9990，回收率在80%～90%，相对标准偏差RSD小于10%。该方法灵敏度高，准确性好，适用于乳制品中L-肉碱的含量测定。

3离子色谱法（IC）

陈军等（2013）提出了离子色谱法（IC）测定减肥食品中左旋肉碱含量的方法。以IonPac CSl7柱为离子交换柱，采用非抑制电导检测器进行检测。该方法测定左旋肉碱的质量浓度在10～1000mg，L范围内与其峰面积呈线性关系，检出限为1mg/g，回收率在95.4%～101%，测定值的相对标准偏差在0.9%～6.6%。

4质谱法（MS）

三组研究人员分别研究了串联质谱法（MS/MS）测定血清中肉碱的方法。Hardy等（2001）开发的MS/MS法需要在质谱分析前对肉碱进行衍生，在衍生过程中乙酰肉碱会发生部分水解，从而影响测定的准确度。Stevens等（2000）研究的MS/MS法不需要衍生反应，但为了避免电喷雾电离过程中的载体干扰，样品在质谱分析前需要棉纤滤纸过滤和一定浓度的甲醇溶液洗脱。Chung Shun Ho等（2003）提出使用液相色谱（LC）来减少载体干扰，研发发现LCMS/MS法操作方便，不需要衍生化，不存在衍生过程的水解问题，且液相色谱可以消除载体干扰因素，适合于血清中游离肉碱和总肉碱的测定。竺琴等（2012）建立了婴幼儿配方奶粉中高效液相色谱—质谱联用测定方法。在优化条件下，样品在10min内完成分析，左旋肉碱在0.40～10.0mg/L范围内呈线性关系，回收率在87%～106%，检出限和定量下限分别为39.0ng、116.9ng。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好、分析速度快，更适用于大量样品的集中快速检测。