黄芩水煎液及黄芩苷抗大鼠肝纤维化药效作用比较研究

孟洪宇 常虹

摘要 目的：探讨比较黄芩水煎液及黄芩苷对肝纤维化大鼠的防治作用及量效关系。方法：采用皮下注射四氯化碳（CCL4）8周诱导大鼠肝纤维化模型，并同时灌胃给予高、中、低剂量的黄芩水煎液及黄芩苷，给药结束后，检测大鼠肝脏病理组织形态;试剂盒检测肝脏HYP，血清肝功能指标（ALT、AST、ALP、GGT）及肝组织匀浆及血清SOD、MDA水平;放免法检测血清肝纤维化指标（HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN）。结果：与模型组比较，中、低剂量黄芩水煎液及黄芩苷均能有效改善大鼠肝功能，降低血清HA、LN、PCⅢ水平及肝脏HYP含量，提高血清及肝组织SOD，降低MDA水平，并尤以低剂量组作用佳，但黄芩水煎高剂量组具有加重肝损伤趋势。结论：中、低剂量黄芩水煎液及黄芩苷均能有效改善大鼠肝纤维化，其机制可能与其抗氧化能力有关。

关键词 黄芩水煎液;黄芩苷;肝纤维化

Comparison Study on Inhibitory Effects of Raix Scutellariae Decoction and Baicalin on Hepatic Fibrosis Rats

Meng Hongyu1， Chang Hong2

（1 Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China; 2 School of Pharmacy，

Baotou Medical College， Baotou 014060， China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effect and dose-effect relationship of Raix Scutellariae decoction and Baicalin on hepatic fibrosis （HF） rats. Methods：HF rat model was established by subcutaneous injection of CCL4 for .8 weeks. Meanwhile， different doses of Raix Scutellariae decoction and Baicalin were administered. Histomorphology of liver tissue was observed. Liver HYP from hepatic tissue， the serum levels of ALT， AST， ALP， GGT， the liver and serum levels of SOD and MDA were detected by Kit. The liver fibrosis indexes including HA， PC-Ⅲ， C-Ⅳ and LN were measured by radioimmunoassay. Results：As compared with those in model group， the liver content of HYP， the serum levels of HA， LN， PCⅢ， the serum and liver levels of MDA， SOD were significantly changed in middle and low dose of Raix Scutellariae decoction and Baicalin groups， which also could significantly improve hepatic function. Additionally， the middle and low dosages were beneficial. However， the high dosage of Raix Scutellariae decoction could obviously aggravate liver injury. Conclusion：Middle and low dose of Raix Scutellariae decoction and Baicalin can effectively improve HF in rats and the action may be completed by antagonizing lipid peroxidation.

Key Words Raix Scutellariae decoction; Baicalin; Hepatic fibrosis

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.039

肝纤维化主要是指各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉积的一种病理过程[1]。它是肝硬化及各种终末期肝病复杂病症发生的基础，但也是其早期可逆阶段[2]。因此，开发安全有效的抗肝纤维化药物进行早期防治，甚至逆转肝纤维化已成为亟需解决的问题。黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒等功效[3];临床常用清肝胆湿热，为黄疸常用药[4]。黄芩具有抗炎、抗菌、保护肝脏等广泛的药理活性，研究证实黄芩具有显著的抗纤维化作用，但多数研究集中于黄酮类有效成分黄芩苷[5-8]，其他有效成分如多糖类等也亦有较强活性如抗氧化作用[9]，因此本实验通过比较不同剂量黄芩水煎液及黄芩苷对肝纤维化的防治作用，以及相应的量效关系，为开发抗纤维化药物及黄芩临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠90只，体重170～200 g，购自北京大学医学部（实验动物科学部），许可证号SCXK（京）2011-0012。

1.1.2 药物 黄芩饮片（批号14101608，内蒙古腾翔中药饮片公司）;黄芩苷（批号20150306，西安沃森生物科技有限公司）;水飛蓟素胶囊（批号131102819，德国博士大药厂）;CCL4（批号20091217，天津市北方天医化学试剂厂）;特级初榨橄榄油（批号20150123，山东鲁花集团有限公司）;丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）试剂盒均购自美国贝克曼公司;超氧化物歧化酶（SOD，批号20150505）、丙二醛（MDA，批号20150421）、羟脯氨酸（HYP，批号20150527）、总蛋白定量测定（批号20150519）试剂盒均购自南京建成;HA、LN、PCⅢ、CⅣ（批号20151020，北京北方生物技术研究所有限公司）。

1.1.3 试剂与仪器 AU640全自动生化分析仪（日本奥林巴斯公司）;XH6080放免仪（西安核仪厂）;酶标仪（美国赛默飞）;NP-T生物组织自动脱水机（孝感市诺普电子科技有限责任公司）;NP-B型生物组织包埋机（孝感市诺普电子科技有限责任公司）;RM2235切片机（德国徕卡公司）;CX31显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将90只大鼠适应饲养1周后，按体重随机分为9组，每组10只。分别为对照组、模型组、黄芩水煎液高（De-h）、中（De-m）、低（De-l）剂量组，黄芩苷高（Bai-h）、中（Bai-m）、低剂量组，阳性对照水飞蓟素（Y）组。模型组及各给药组大鼠按3 mL/kg（首次5 mL/kg）腹部皮下注射40% CCL4橄榄油液，2次/周，持续8周;对照组注射等量橄榄油液。造模同时给药，De-h、De-m、De-l组分别以3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg灌胃给予黄芩水煎液;Bai-h、Bai-m、Bai-l分别以25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg给予黄芩苷水溶液;Y组以50 mg/kg灌胃给药;模型组和对照组按大鼠体重5 mL/kg灌胃给予生理盐水。

1.2.2 检测指标与方法 1）病理组织学检查：各实验组待8周实验结束，麻醉处死后于肝右叶中部切取1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm大小肝组织一块置于多聚水合氯醛中固定;进行石蜡包埋，常规切片，行苏木精伊红染色（HE）染色，光镜下观察切片情况，描述肝脏病理变化。2）肝功能指标检测：实验8周后，腹主动脉取血，4 ℃，3 000 r/min离心，分离上层血清，以全自动生化仪进行检测。3）肝纤维化指标检测，放免法检测HA，LN，PCⅢ及CⅣ。4）肝组织HYP检测：比色法测定肝组织匀浆HYP，以酶标仪进行测定。5）抗氧化指标的测定：酶标仪检测血清及肝组织MDA及SOD。所有操作均严格按照试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠精神状态良好，体重稳定增加;模型组大鼠第2周精神萎靡、体毛蓬松、进食减少、大便稀溏，体重增长缓慢，4周之后，大鼠精神状态改善，但皮肤出现溃烂;黄芩水煎高剂量组前2周大鼠尿量增加，大便稀溏，体重下降，体毛发黄，随后逐渐改善，体重增长稳定;黄芩水煎中、低剂量组，黄芩苷各剂量组及水飞蓟素组大鼠精神状态较模型组有改善。

2.2 黄芩对肝纤维化大鼠肝组织形态影响

2.2.1 肝组织大体形态改变 对比实验第8周时各组肝组织形态，结果显示正常对照组大鼠肝脏颜色鲜红，质嫩;模型组肝脏表面颗粒样变严重，有花斑样改变，质硬，边缘钝有些大鼠肝脏甚至由于产生大量再生结节与其他脏器黏连。各给药组情况较模型组改善。

2.2.2 HE染色分析 图1为HE染色结果：对照组大鼠肝组织结构清晰，肝细胞排列整齐。模型组大鼠肝脏汇管区周围纤维化并且大量增生，将肝小叶分割包绕成假小叶，肝细胞脂肪变性、坏死，并有炎性细胞浸润;De-h组（图1C）肝组织结构未见改善，仍有假小叶，但De-m、De-l组（图1D，E）大鼠肝小叶结构均有不同程度的改善，尤以低剂量组效果佳。黄芩苷各剂量组（图1F，G，H）大鼠肝脏肝小叶结构也得到修复，胶原纤维增生减少，仍以中、低剂量改善程度佳。阳性药物（图I）水飞蓟素组虽得到改善，但效果低于黄芩水煎液及黄芩苷中、低剂量组。提示黄芩对肝脏具有一定保护作用，可减少胶原的增生，减轻肝损伤，但要注意剂量的选择。

2.3 黄芩对肝纤维化大鼠肝功能指标ALT、AST、ALP、GGT的影响 图2结果显示，模型大鼠各血清指标较对照组均显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组均能显著降低血清ALP水平，差异有统计学意义（P<0.05），且Bai-l组与对照比较差异无统计学意义，但De-l组则加重肝纤维化大鼠ALT，差异有统计学意义（P<0.05），提示高剂量黄芩水煎液有肝损伤作用;De-l、Bai-l组均可有效降低AST水平（分别P<0.05，P<0.01），且Bai-l组与对照组比较，差异无统计学意义;Bai-m、Bai-l及阳性药物组可有效降低GGT水平（分别P<0.05，P<0.01，P<0.01），且与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。从黄芩对这些肝功能指标的影响结果可见，中、低剂量黄芩水煎液及黄芩苷均能有效改善大鼠肝脏功能，尤以低剂量组效果最佳，且综合比较优于阳性药物组，但高剂量的黄芩水煎液可能具有肝损伤作用，与病理结果一致。

图1 肝组织HE染色病理形态结果（100倍）

注：（A）对照组;（B）模型组;（C-E）黄芩水煎液高、中、低剂量组;（F-H）黄芩苷高、中、低剂量组;（I）阳性药物组。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01

图2 不同组对肝纤维化大鼠血清ALT、AST、

ALP、GGT的影响

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4 黄芩对肝纤维化大鼠血清HA，LN，PCⅢ及CⅣ的影响 图3结果显示，与对照组比较，模型组血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，De-l、Bai-m、Bai-l组及阳性药物组均能显著降低血清HA水平，差异有统计学意义（P<0.05），且与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但Bai-h组则显著增高HA水平，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，仅Bai-l组及阳性药物组能够显著降低LN水平，差异有统计学意义（P<0.05），并且黄芩苷低剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），优于阳性药物组;De-l、Bai-m、Bai-l组及阳性药物组与模型组比较，均能显著降低PCⅢ水平，差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 不同组对肝纤维化大鼠血清HA，

LN，PCⅢ及CⅣ的影响

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.5 黄芩对肝纤维化大鼠肝组织HYP的影响 图4结果显示与正常组比较，模型组大鼠HYP值显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组除De-h、Bai-h组，其余各组均能显著降低HYP水平，差异有统计学意义（P<0.05）。

图4 不同组对肝纤维化大鼠肝组织HYP的影响

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.6 黄芩对肝纤维化大鼠血清及肝组织匀浆SOD，MDA的影响 图5结果显示，与对照组比较，模型组血清和肝组织SOD显著降低，血清和肝组织MDA水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，黄芩水煎及黄芩苷各剂量组能够显著降低血清及肝组织MDA水平（P<0.01），除De-h组，各组均能显著提高血清及肝组织SOD水平，差异有统计学意义（P<0.05）。虽De-h组未能显著提高肝纤维化大鼠抗氧化能力，但仍有改善趋势，与病理及血清肝纤维化指标所示结果不呈正相关，根据实验结果，推测黄芩能够通过抗氧化作用，改善肝功能和肝纤维化。

图5 不同组对肝纤维化大鼠肝组织

及血清SOD、MDA的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01

3 讨论

肝纤维化是由于胶原为主的细胞外基质（ECM）在肝内合成与降解失衡，造成过多沉积而形成[10]。透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型前胶原蛋白（CⅣ）是构成ECM的主要成分，其中HA属于ECM中蛋白多糖，能较早反映肝细胞损伤，是反映肝纤维化的敏感指标;LN是一种细胞外基质非胶原糖蛋白;PCⅢ是ECM的主要成分，能够较好的反映肝纤维化程度，也是目前研究最多反映肝纤维化活动性的血清标志物;CⅣ是基底膜的主要成分[11]。这4个指标联合能较为客观的反映肝纤维化程度，用于临床纤维化疾病的诊断与疗效评价。HYP为胶原蛋白分子所特有，约占胶原蛋白氨基酸总量的13.4%，它的含量可以反映胶原代谢情况而直接反映肝脏纤维化程度[12]。实验结果表明一定剂量的黄芩水煎剂及黄芩苷能够不同程度的降低血清HA、LN、PCⅢ水平，尤以Bai-l组最佳，其中De-h更加重HA升高，可能为其加重肝纤维化的机制之一。黄芩水煎液和黄芩苷的中、低剂量组及阳性药物组能够不同程度的降低HYP水平，尤以黄芩苷低剂量组最佳。推测中低剂量的黄芩能够通过减少ECM过度堆积，发挥抗肝纤维化作用。同样作为诊断肝纤维化“金标准”的病理结果同样显示，除De-h组，各给药组均有不同改善，且黄芩苷高剂量组作用低于黄芩苷中低剂量组，提示对于黄芩苷及黄芩水煎液均有抗纤维化作用，但不与剂量呈正相关，大剂量可能有肝损伤，应用时应注意量的选择。

氧化应激是纤维化发生的重要机制，当细胞受损时会释放活性氧物质，引起炎性反应细胞浸润，释放众多促纤维化因子，而引起的ECM的堆积[13]。SOD是机体内广泛存在的一类重要的过氧化物分解酶，是机体抗过氧化能力指标之一。MDA是一种氧化应激因子是脂质过氧化的最终产物。因此本实验通过检测药物对模型大鼠提升SOD、清除MDA的能力，来评价药物抗氧化能力，揭示其机制。实验结果表明，黄芩水煎剂及黄芩苷组各剂量均能降低肝纤维化大鼠血清和肝组织MDA水平，除De-h组均能提高血清及肝组织SOD水平;提示黄芩能够通过抗氧化作用抗肝、肺纤维化。

本研究通过对比黄芩水煎液及黄芩苷对肝纤维化大鼠作用，发现中、低剂量黄芩具有良好的抗纤维化作用，总体而言，黄芩苷优于水煎液，其作用机制及大剂量肝损伤机制有待深入研究。

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