强心安神汤对慢性心衰大鼠AngⅡ及AT1mRNA表达的影响

颜旭 刘春华 庄红 陈琪 张婷 赵启 蔡雷

〔摘要〕 目的 研究强心安神汤对Wistar慢性心衰模型大鼠AngⅡ含量及AT1 mRNA表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法 除空白组外，将Wistar大鼠造模后分为模型组、西药组、强心安神汤高剂量组及强心安神汤低剂量组，干预4周后，抽静脉血以免疫组化法测定大鼠血清中AngⅡ的含量；处死大鼠，提取心肌组织，以RT-PCR法检测心肌组织AT1 mRNA的表达。结果 强心安神汤组大鼠血清AngⅡ含量及AT1 mRNA表达与模型组及西药组比较，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论 强心安神汤治疗心衰的机制可能与其抑制AngⅡ引起的AT1 mRNA表达上调有关。

〔关键词〕 慢性心衰；强心安神汤；AngⅡ；AT1mRNA

〔中图分类号〕R285.5；R541.6 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.007

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Qiangxin Anshen decoction on the expression of AngⅡand AT1 mRNA in the model of Wistar rats with chronic heart failure， and investigate its possible mechanism. Methods Except for the blank group， the model rats were randomly divided into model group， Western medicine group， high-dose Qiangxin Anshen decoction group and low-dose Qiangxin Anshen decoction group. After intervention treatment for 4 weeks， the content of AngⅡof serum in rats was measured. The rats were killed and the AT1 mRNA expression in myocardial tissues were detected. Results Compared with the model and Western medicine groups，the content of AngⅡ in the rats serum and AT1 mRNA expression of myocardial tissues in Qiangxin Anshen decoction group was statistically significant （P﹤0.05 or P<0.01）， Conclusion The mechanism of Qiangxin Anshen decoction in treating heart failure may be related with the up-regulation of AT1 mRNA expression caused by restraining Ang II.

〔Keywords〕 chronic congestive heart failure； Qiangxin Anshen decoction； AngⅡ； AT1 mRNA

慢性心力衰竭（congestive heart failure， CHF）是一种常见的、多发的心脏疾病，现代医学的飞速发展，并没有降低慢性心衰的病死率。我院心内科在多年的中西医结合临床实践及实验中发现以“益气滋阴、强心安神”为法组方的“强心安神汤”治疗慢性心衰可以显著改善患者临床症状、体征及实验室指标，减轻心衰大鼠心肌细胞损伤[1-2]。本文观察强心安神汤对慢性心衰大鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及AT1mRNA表达的影响，探讨其可能的作用机制，现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 實验药物 “强心安神汤”组成为：炙黄芪、制首乌、酸枣仁、阿胶、香加皮、葶苈子、三七、黄连、肉桂等，采用超微颗粒，由湖南春光九汇现代中药有限公司提供；盐酸阿霉素注射液（批号：1004E1），由浙江海正药业股份有限公司提供；生理盐水，由四川科伦大药厂生产；注射用水，由天津药业焦作有限公司生产；倍他乐克，由阿斯利康制药有限公司生产；卡托普利，由浙江南洋药业有限公司生产。

1.1.2 实验动物 Wistar大鼠80只，由湖南中医药大学动物中心提供，雌雄各半，体质量（200±20） g，随机分为造模组68只及空白组12只。饲料、垫料均由湖南中医药大学动物中心提供。动物实验室环境：温度20～25 ℃，湿度 45%～55%。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）检测试剂盒由北京北方生物技术研究所生产；RT-PCR试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司生产。TC48/T/H（a）型PCR仪由杭州大和热磁电子有限公司生产；GE-100型水平电泳仪由杭州大和热磁电子有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 Wistar大鼠慢性心衰模型的复制 根据文献[3]，造模组采用腹腔内注射阿霉素法，第1～3周按3 mg/kg剂量进行腹腔注射，第4～6周按2 mg/kg剂量进行腹腔注射；1次/周，复制心力衰竭模型。空白组注射等容量生理盐水，每周1次，连续6周。每天观察记录大鼠的精神状态、活动、饮食、体质量的变化及呼吸频率等日常习惯的改变情况，6周后，根据大鼠行为方式的改变及心脏超声测量大鼠左室射血分数（LVEF）、左室收缩率（LVFS）及ELISA法检测大鼠血清脑利钠肽（BNP）水平的变化判断造模成功与否。

1.2.2 实验分组及干预 将复制心衰模型成功的55只大鼠，选取48只，随机分为模型组、西药对照组、强心安神汤高剂量组、强心安神汤低剂量组，另设一组作为空白组，每组12只，各组动物给予同等条件下饲养。空白组和模型组每日予以同等容量的生理盐水灌胃；西药组，将倍他乐克及卡托普利配制成水溶液，按2.7 mg/（kg·d）灌胃；中药给药剂量按临床成人剂量×动物等效剂量系数换算后为强心安神汤低剂量组每日给药剂量，其4倍值为高剂量组每日给药剂量。具体为低剂量组按6.93 g/（kg·d）灌胃；高剂量组按27.72 g/（kg·d）灌胃，连续干预4周。

1.2.3 标本采集与检测 （1）血清AngⅡ测定：各组大鼠连续干预4周，于最后一次给药后禁食12 h，麻醉后于股静脉处采血6 mL，分别置于EDTA、肝素抗凝试管中，4 ℃、3 000 r/min离心，分离血浆，低温下保存待测，由湖南省中西结合医院免疫生化室完成。（2）心衰大鼠AT1 mRNA的检测：处死大鼠，取心肌组织75 mg置于DECP处理过的研钵内，倒入液氮，迅速研磨成粉末状，加入Trizol反应液1 mL裂解细胞，室温孵育5～10 min。加入氯仿0.2 mL，剧烈震荡15 s，室温孵育3 min。12 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集无色上层水相于1.5 mL于另一离心管中，弃沉淀管，加入0.5 mL异丙醇，振荡混匀，室温孵育5～10 min。12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇并振荡。9 000 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清，空气中干燥5～10 min。加入20 μL DEPC处理的无RNA酶的水溶解RNA，置-70 ℃保存。以A260/280法检测RNA纯度及浓度表示无严重DNA污染，RNA纯度较高，样本无严重RNA降解，符合试验要求。按M-MLV逆转录酶说明书合成cDNA。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（具体见表1）；扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；57 ℃退火40 s；72 ℃延伸40 s；35个循环扩增后，72 ℃延伸10 min。通过图像分析软件读取凝胶电泳条带光密度扫描值，将条带与内参电泳条带的比值作为目的基因mRNA的表达量。即：mRNA相对表达=样品扫描值/内参扫描值。

1.3 数据处理及统计学分析

采用SPSS 15.0软件处理数据。计量资料采用“x±s”进行统计描述。多组数据分析采用单因素方差分析检验，方差齐时采用最小显著差数法（LSD）法；方差不齐时选用Tamhane's T2法。取P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

如表2和图1-2所示，模型组心衰大鼠AngⅡ水平及大鼠心肌组织AT1 mRNA表达显著高于空白组（P<0.01）；分别给予强心安神汤及西药干预后，各干预组AngⅡ水平及AT1 mRNA表达均较模型组显著降低（P<0.05或P<0.01）；强心安神汤高剂量组及低剂量组与西药组比较，AngⅡ水平及AT1 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。而强心安神汤高、低剂量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

现代医学研究发现，慢性心衰的基本机制是神经内分泌介导的心室重构，肾素-血管紧张素系统的过度激活促进了心衰的发生与发展[4]。肾素活性增加，作用于血管紧张素原，刺激血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）分泌增加，AngⅠ被ACE分解为AngⅡ，AngⅡ通过自分泌和（或）旁分泌机制作用于AT1来活化心肌细胞G蛋白与磷酯酰肌醇特异性磷酸脂酶C耦联，引起心肌细胞钙离子内流和胞浆内钙离子贮存池释放增加，表现为收缩血管，增强心肌收缩力，并诱导相关蛋白激酶激活，继而诱导蛋白质合成的增加，触发心肌肥大、纤维组织和血管增生。郭志坤等[5-7]研究证实，AngⅡ通过其特异的AT1受体介导，参与细胞增殖、迁移，最终导致血管壁及心肌增生肥厚，心室重构。何松坚[8]、徐建辉[9]、LI M[10]、楊艳峰[11]等人的研究表明，通过抑制肾素-血管紧张素系统过度激活，从而抑制Ang Ⅱ引起的AT1 mRNA表达上调，可以阻断心肌肥厚的发生，改善早期心肌纤维化、减轻早期心室重构、改善预后。

慢性心衰属于中医学“心衰”范畴，既往主要根据临床表现分别归属于“心悸、胸痹、喘证、痰饮、水肿”等病证范畴。“心衰”病位在心，与肺、肾、脾关系密切。本病基本病机为“本虚标实，虚实夹杂”，本虚指“心气虚、心阳虚”，标实主要是寒凝、气滞、痰浊、水饮、瘀血。其中，心气亏虚为本病之始，心气亏虚导致气阴两虚，渐至心阳亏虚，阳虚血瘀，心阳虚损，累及肾阳，从而心肾阳虚，阳虚则寒痰凝滞，水湿不行，痰饮阻肺或阳虚水泛，阴竭阳脱。本病后期总是伴随心阴的损伤或心阴阳两虚。由此可见“益气”与“滋阴”是治疗心衰的两个重要方面，而且心衰患者在长期的治疗过程中因利水消肿及温壮心阳叠进更加耗气伤阴从而导致心气阴亏虚尤甚。心阴（血）亏虚，血不养心，滋生内热，扰动心神；肾阴（精）亏虚，不能上济以“滋心阴、涵心阳”，以致心火内动，扰动心神。所以，可以认为“气阴两虚、心神不宁”是“心衰”中的一个常见证型，故以“益气滋阴，强心安神”立法，组方“强心安神汤”，以期标本同治之功。

本实验研究结果表明：强心安神汤可显著降低大鼠血清的AngⅡ水平，抑制AT1 mRNA表达，与西药组及模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），其作用结果无明显量-效依赖关系。本实验为临床应用强心安神汤治疗慢性心衰提供了一定的实验依据，但是，中药复方汤剂组分复杂，煎煮后可能产生更多的变化，因此强心安神汤除了对肾素-血管紧张素系统的影响以外，是否还有更多更重要的作用机制和作用靶点，还有待于进一步临床及实验研究。

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