川蔓藻内生及根际细菌多样性与抑菌活性研究

李菲　高程海　余炼　李家怡　易湘茜

摘要： 该研究采用稀释涂布法结合形态观察、16S rRNA基因序列分析，对广西北海川蔓藻（Ruppia maritima）内生及根际细菌的物种多样性进行了研究，并采用琼脂扩散法和光度计法分析了其粗提物抑制马尔尼菲青霉菌活性。结果表明：从川蔓藻中分离到可培养内生细菌26株，根际可培养细菌31株。分别将内生细菌归属为10科12属13种，根际分离出细菌归属为9科14属19种，其中5株根际细菌可能为潜在新种。获得8株细菌对马尔尼菲青霉菌有抑制活性，总阳性率为25.0%。其中，菌株BGMRC 2015、BGMRC 2059、BGMRC 2043的粗提物表现出较强的抑制马尔尼菲青霉菌效果，其MIC分别为（1.800±0.045）、（1.881±0.061）、（1.604±0.021）mg·mL-1。川蔓藻中可培养细菌具有较高的物种多样性，蕴藏着丰富的新物种资源，且富含抑菌活性良好的菌株。

关键词： 川蔓藻， 细菌， 物种多样性， 马尔尼菲青霉菌， 抑菌活性

中图分类号： Q939.1文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2018）07-0924-10

Abstract： The purpose of this study was to investigate the diversity of endophytic and rhizospheric bacteria of Ruppia maritima collected from Beihai City and antifungal activities against Penicilliosis marneffei. The endophytic and rhizosphere bacteria isolated from Ruppia maritima were analyzed by method of dilution butteron on plate. 16S rRNA gene sequencing was employed to explore species diversities and the effects of the crude extract from bacteria against Penicilliosis marneffei with agar diffusion method and spectrophotometer method. Total of 26 strains of endophytic bacteria and 31 strains of rhizosphere bacteria were isolated from Ruppia maritina. Thirteen species of endophytic bacteria were obtained and classified into twelve genera and ten families. Nineteen species of bacteria were isolated from rhizosphere and belonging to fourteen generas and nine families. And five strains in the rhizosphere were potential new genera. Crude extracts of eight strains showed inhibition effect against Penicilliosis marneffei， three of which had strong antifungal activities， and their MIC50 were （1.800 ± 0.045）， （1.881 ± 0.061） and （1.604 ± 0.021） mg·mL-1. Endophytic and rhizospheric bacteria of Ruppia maritima are genetically diverse and most of them showed strong inhibition effects against Penicilliosis marneffei.

Key words： Ruppia maritima， bacteria， species diversity， Penicilliosis marneffei， antifungal activities

马尔尼菲青霉菌（Penicilliosis marneffei）是一种独特的具有传染性的二相性真菌，在东南亚地区的艾滋病患者中最为常见，通常能感染AIDS患者及使用类固醇皮质激素的病人，可作为诊断AIDS的一个辅助指标（Huang et al， 2013）。马尔尼菲青霉菌是一种条件致病菌，容易感染免疫功能低的人群，并引发播散性的马尔尼菲青霉病。近年来，激素和免疫抑制剂以及广谱抗生素使用广泛，加上介入治疗和器官移植的开展，艾滋病病人增加迅速，原发性和继发性免疫功能低的人群逐渐扩大，因此马尔尼菲青霉病不断增多。若不能及時获得确诊和有效的抗真菌治疗，其死亡率极高（Wong et al，2001）。目前，治疗马尔尼菲青霉菌病的药物有氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B等，往往都是两种及两种以上药物结合使用。氟康唑作为首选药物，其副反应小，但治疗青霉菌疗效差，复发率高。因此，寻找到低剂量、高活性及副反应小的马尔尼菲青霉菌抑制剂显得尤为重要。

川蔓藻是一种分布广泛的底栖水生维管束植物，是全球温带、亚热带海域及盐湖地区中发生自然恢复的先锋植物，具有强的耐盐性和去除氮磷能力。据报道，川蔓藻中的化学成分具有很好的生物活性，Dellagreca et al（2000）从川蔓藻中分离到7种具有抑制小球藻和羊角月牙藻活性的半日花烷型二萜类化合物。目前，川蔓藻的研究工作大部分集中在培育、防护、生态作用及其内在成分影响因素上，而关于川蔓藻相关微生物研究未见报道，且马尔尼菲青霉菌体外活性筛选的研究也鲜有报道。对广西北海滩涂川蔓藻（Ruppia maritima）中可培养内生和根际细菌进行多样性分析，并展开细菌发酵粗提物对马尔尼菲青霉菌的抑制活性研究，以期为广西北海滩涂川蔓藻开发利用以及临床耐药性马尔尼菲青霉菌抑制剂的研发提供前期基础。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本2015年4月27日直接在广西北海滩涂（108°50′42″ E，21°55′25″ N）采集川蔓藻。用密封袋装好，并将根部周边土壤一起装在密封袋内，带回处理。

1.1.2 试剂和仪器试剂：培养基原料、TAE缓冲液、2×EasyTaq SuperMix、引物（27f和1492r）、DNA Marker、GoldView核酸染料等购自北京康为世纪生物科技有限公司；Chelex-100树脂购自美国BioRad公司；其他有机试剂均为国产的分析纯试剂。仪器：SW-CJ-2F型超净工作台（杭州佳滤设备有限公司），HH.B11-BS-II型恒温培养箱（东莞市恒宇仪器有限公司），恒温振荡器（美国CRYSTAL），VB-55型高压灭菌锅（德国SYSTEC），MINIB-100型金属浴（杭州米欧仪器有限公司），MINI-6k型迷你离心机（常州市国旺仪器制造有限公司），Tgradient型PCR扩增仪（德国Biometra），电泳仪（美国BioRad），N1000型旋转蒸发仪（日本EYELA），凝胶成像仪（Carestream），VCX750细胞破碎仪（美国Sonics）。

1.1.3 培养基（1）分离培养基：2216E，M10，M7，M9和AGG，详情见表1。（2）纯化培养基为改良的ISP2固体培养基。其中，酵母提取物为2.0 g，麦芽提取物为2.0 g，葡萄糖为2.0 g，琼脂为14.0 g，海水为1 000 mL。（3）发酵培养基为改良的ISP2液体培养基。（4）指示菌培养基为PDA固体培养基和RPMI 1640液体培养基。

1.1.4 指示菌马尔尼菲青霉菌，购买于北京百欧博伟生物技术有限公司。

1.2 菌株的分离纯化

1.2.1 植物组织预处理参照沟叶结缕草表面灭菌方法（王栋等，2008），先将川蔓藻用无菌水清洗，再用75%的酒精溶液浸泡2 min，最后用无菌水冲洗3遍以去除酒精。收集川蔓藻的最后1次漂洗液（表面消毒后的），并涂布在ISP2平板上，28 ℃培养72 h后若未见菌落生长，说明川蔓藻表面消毒彻底。取样品0.5 g进行研磨，先在研磨好的样品中加入1 mL的无菌水，混合均匀后，制成10-1的植物悬液，然后依次制成10-2、10-3稀释度的样液，待用。

1.2.2 根际预处理用灭菌的竹签轻轻拨开川蔓藻根部土壤，使其根系暴露出来，收集根须表面附着的土壤（距离根须5 mm以内），先称取2.0 g土壤样品装于20 mL无菌水（内有玻璃珠）的锥形瓶中，手动摇匀，使其充分均质即可，然后依次制成10-2、10-3稀释度的样液，尽快涂布处理。

1.2.3 接种分别取各梯度稀释后的样液0.2 mL，接种于5种分离培养基中，每个浓度梯度平行接种于2个平板，28 ℃培养21 d后观察形态变化，并挑选不同的菌落进行纯化，同时记录菌落数和形态特征。将纯化后的菌株制成冻干牛奶管于4 ℃中保存，同时制成20%（v/v）甘油管保存于-80 ℃中。

1.3 16S rRNA的系统发育分析

用chelex-100树脂提取菌种的DNA（周双清等，2010），PCR扩增参照Walsh et al（1991）的方法进行。扩增和测序引物均为细菌通用引物，即27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反应条件：94 ℃预变性8 min，94 ℃变性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环，循环结束后，72 ℃延伸维持10 min。将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托上海美吉生物医药技术有限公司广州分公司进行测序。将5株潜在新种的PCR扩增产物条带切胶回收，连接pEASY-T1克隆载体后，转化至Trans-T1感受态细胞中，通过蓝白筛选，挑取阳性克隆子，采用PCR法验证克隆的片段大小并送上海美吉生物医药技术有限公司广州分公司测序。将测序结果利用DNAStar软件进行整理，用EzTaxon服务器（http：//www.eztaxon.org/）进行在线比对；选取同源性最高的菌株序列作为参比对象，用MEGA5.0软件，采用Neighbor-Joining法构建系统树，用Boostrap 1 000次检测各分支的置信值，对各菌株的系统发育地位进行分析（Tamura et al， 2011）。

1.4 细菌粗提物对马尔尼菲青霉菌的敏感性

1.4.1 琼脂扩散法筛选活性菌株采用改良的琼脂扩散法（韦高和李菊裳，2005）测定马尔尼菲青霉菌扩散区域大小。挑取少量菌体，接种于RPMI 1640液体培养基中，于25 ℃、180 r·min-1下摇床培养24 h，制备菌悬液。将1%菌悬液（v/v）加入灭菌后的PDA固体培养基（冷却至55 ℃左右）中混匀，将15 mL培养基倒入灭菌平皿中。待培养基凝固，然后将培养好的马尔尼菲青霉菌打成直径为6 mm的菌饼（初始菌饼）贴于平皿中，使有菌丝面朝下贴于每个含待测菌的PDA固体培养基中，每个板4块菌饼，阴性对照为PDA固体培养基，25 ℃恒温培养。隔天观察一次结果，并用游标卡尺测定马尔尼菲青霉菌扩散区域大小，每个实验重复2次。

1.4.2 光度计法确定MIC值根据真菌药物敏感试验的标准化文件中的M38-A2（丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第二版）说明，设计体外抑制马尔尼菲青霉菌活性測定实验。

1.4.2.1 阳性对照组浓度值的确定参照体外抗真菌药敏实验微量稀释（Morace et al， 2002）、酶标仪测定抗菌物质抑菌活性（周子雄等，2014）和气丝状真菌吸光度测定（Kajimura & Kaneda， 1996）。在无菌条件下，使用96孔板进行实验。以马尔尼菲青霉菌作为目的菌株，将菌接种于PDA培养基上，25 ℃培养3 d，用RPMI 1640液体培养基配制孢子悬浮液，使得培养液中孢子浓度为0.4～5×104 cfu·mL-1。将100 μL孢子悬浮液加入96孔板中，用少量DMSO溶解两性霉素B（AMB）和酮康唑（KET），分别加入96孔板中，使其终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1及10 μg·mL-1。平衡5 min后，测定540 nm波长的OD值，记为OD1值；将96孔板放置25 ℃培养3 d后，测定540 nm波长的OD值，记为OD2值。以DMSO作为空白对照。实验重复2次，确定两性霉素AMB的MIC100（完全抑制真菌的最小抑制浓度的MIC，下同）和酮康唑KET的MIC80（抑制80%真菌最小抑制浓度的MIC，下同），重复实验验证，最终确定两性霉素B（AMB）和酮康唑（KET）对马尔尼菲青霉菌最低抑制浓度MIC值。

计算公式：

抑制率=△OD空白组-（OD1-OD2）△OD空白组×100%。

1.4.2.2 细菌粗提物的制备将活性好的细菌置于ISP2固体培养基上培养，取生长于对数期后的菌株接种于装有100 mL发酵培养液的500 mL锥形瓶中，每株菌接种6瓶，180 r·min-1，28 ℃培养7 d。发酵液用细胞破碎仪处理20 min，将处理后的发酵液用1∶1（v/v）乙酸乙酯萃取3次，每次间隔至少20 min。浓缩干燥后，置于干燥器中保存，备用。

1.4.2.3 菌株发酵粗提物的最小抑制浓度MIC50将马尔尼菲青霉菌接种于PDA固体培养基上，25 ℃培养3 d，用RPMI 1640液体培养基配制孢子悬浮液，使得培养液中孢子浓度为0.4～5×104 cfu·mL-1。用DMSO和RPMI 1640液体培养基将菌株发酵粗提物配制一系列浓度药液。取100 μL菌悬液和100 μL药液加入96孔板中，药液終浓度为1.25、2.5、5.0 mg·mL-1。每浓度设置3个平行，以4 μg·mL-1酮康唑为阳性对照组，DMSO为空白对照。记录和计算数据，每组实验重复两次。

2结果与分析

2.1 川蔓藻中内生及根际细菌多样性分析

采用5种分离培养基，从川蔓藻组织和根际中分别分离到可培养内生细菌26株和31株，按照菌落的大小、形态、颜色和出现时间等进行细菌排重，选取44株细菌进行16S rRNA基因序列对比，获得13种内生细菌及19种根际细菌，隶属于14科24属（表2）。

初步鉴定结果表明，川蔓藻内生细菌隶属于3门8科12属。根据13株内生细菌及其参比菌株的16S rRNA基因序列构建的N-J系统进化树（图1）。初步鉴定结果表明，川蔓藻根际细菌隶属于4门8科14属。根据19株根际细菌及其参比菌株的16S rRNA基因序列构建的N-J系统进化树（图2）。

从川蔓藻根际中分离到5株细菌的16S rRNA基因序列（约1 500 bp），它们与其最近缘的典型菌株序列相似性低于97%。菌株BGMRC 2019与红杆菌科的有效发表菌株Albidovulum xiamenense YBY-7T （HQ709061），BGMRC 2046与Stappia_f科的有效发表菌株Stappia indica B106T （EU726271），BGMRC 2048与黄杆菌科的有效发表菌株Hwangdonia seohaensis HD-3T（JX546142），BGMRC 2050与根瘤菌科的有效发表菌株Rhizobium sphaerophysae CCNWGS0238T（FJ154088），BGMRC 2054与红杆菌科有效发表菌株Oceanicola litoreus M-M22T（JX291104）发育关系最密切，其相似率分别为93.46%、95.96%、95.27%、96.10%和96.03%。基于16S rRNA基因序列，5株潜在新种与其所在菌科中邻近菌株构建的N-J系统进化树，均能与其相似菌株在进化树上聚为一簇，在采用Maximum-Likelihood法和Maximum-Parsimony法构建的系统进化树中5株菌种同样形成了一个独立分枝。由此推测，菌株BGMRC 2019、BGMRC 2046、BGMRC 2048、BGMRC 2050及BGMRC 2054分别为红杆菌科、Stappia_f科、黄杆菌科、根瘤菌科及红杆菌科中的一个潜在新分类单元。

2.2 不同培养基对内生及根际细菌的分离效果

采用5种分离培养基，从川蔓藻组织及其根际中分离到细菌共57株，其中将44株细菌进行测序比对，它们在不同培养基上的分离效果如图3所示。从5种分离培养基的分离效果来看，M10培养基（含有水解酪素）分离到的细菌种类最多，包含12个菌属；M9培养基（含有精氨酸、寡营养）分离到的细菌种类最少。根据菌落数的统计结果，AGG、M10、M7、M9和2216E培养基上菌落数分别为1.2×105、1.8×105、4.0×104、6.0×104和5.0×104 cfu·mL-1。M10分离培养基获得13株细菌，隶属于12属，其获得的菌株数和多样性均较高；M9分离培养基获得5株细菌，获得的细菌数较少，且多样性较少。就新颖性而言，16S rRNA基因序列相似性小于97%的菌株共有5株，占分离细菌总数的8.77%。其中2株潜在新菌（2048和2054）从M10培养基分离获得，4株（2019，2046，2048和2050）潜在新菌从2216E培养基分离获得。

2.3 内生及根际细菌的属级水平上的韦恩图分析

在属级水平上对川蔓藻组织及其根际来源细菌进行venn分析（图4），从川蔓藻组织来源的13株细菌，隶属于12属，而从根际来源的19株细菌，隶属于14属。韦恩图显示，从川蔓藻组织和根际中获得细菌种类存在较大的差异，共同含有两个属Pseudomonas sp.和Bacillus sp.。

2.4 细菌发酵粗提物对马尔尼菲青霉菌的抑制活性

2.4.1 活性菌株筛选结果对分离纯化的32株细菌进行活性筛选，结果表明，有8株细菌具有抑制效果，总阳性率为25.0%。其中，有3株细菌表现出极强的抑制效果（图6）。马尔尼菲青霉菌扩散的区域越小，其生长受到抑制作用越大，反之则越小。空白对照板的马尔尼菲青霉菌扩散区域达到18～25 mm，实验组的马尔尼菲青霉菌扩散区域小于12 mm，含BGMRC 2043菌液板上未观察到马尔尼菲青霉菌扩散区。

2.4.2 光度计法确定MIC值重复实验结果显示，两性霉素B（AMB）的MIC100为（3.573±0.121）μg·mL-1，酮康唑（KET）的MIC80为（3.828±0.074）μg·mL-1，DMSO对马尔尼菲青霉菌无抑制作用。

选取3株活性高的菌株进行抑菌活性效果测定。表3结果显示，在药液浓度为1.25 mg·mL-1时，2015和2059菌对马尔尼菲青霉菌的抑菌率均很相近，而2043菌株的抑菌率是2015和2059菌的近两倍；在药液浓度为2.5和5.0 mg·mL-1时，2015、2059和2043菌对马尔尼菲青霉菌的抑菌率均很相近。用SPSS软件计算3株细菌粗提物抑制50%马尔尼菲青霉菌的药物浓度，即MIC50。2043菌株粗提物的抑菌效果最佳，其MIC50为（1.604±0.021）mg·mL-1；2015和2059菌的抑菌效果相近，其MIC50值分别为（1.800±0.045）、（1.881±0.061）mg·mL-1。另外，阳性对照选用4 μg·mL-1酮康唑，其抑菌率为0.859 2±0.012。

3讨论

存在于潮间带生态系统中的微生物类群具有高生产力和多样性，它们不断将凋亡的潮间带生物中的营养物质转化为植物可利用的C、P等，同时潮间带植物茎、叶、根的渗出物又為微生物的生长提供养分，使其周围的微生物多样性更加丰富（杨隽娴，2008）。与南方沿海潮间带生长的红树植物相比，近海潮间带盐生植物的研究相对较少。图 5培养1周后马尔尼菲青霉菌的抑制效果川蔓藻作为一种盐生植物生存在潮汐带间，与陆地人工培育的川蔓藻的生存环境极其不同，其代谢途径会为了适应生存环境而发生相应改变。为了掌握广西北海滩涂上川蔓藻中可培养的内生与根际细菌组成，本研究分别对川蔓藻的组织与根际进行采样，利用5种培养基，从中分离获得了大量细菌资源。研究发现，川蔓藻内生及根系呈现出较高的细菌生物多样性，从川蔓藻中分离到可培养内生细菌26株，归属为10科12属13种；根际可培养细菌31株，归属为9科14属19种，其中5株根际细菌为潜在新物种。其中，在植物内和根际中均分离到优势菌属Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，其能广泛分布在动植物内部及其生长的环境，两者间即存在着相互竞争，又相互产生作用。普遍认为，根际土壤细菌是植物根部内生细菌主要来源，它在植物根系的微生物环境中对物质和能量的转化起重要作用（庞欣等，2000）。结果显示，在植物内和根际中分离到两个共同属，即Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，这一结果与部分研究报道大相庭径。陆松柳等（2011）研究发现，植物根际微生物的数量、类群、优势种等存在很大差异，这主要与植物根系分泌物的种类和数量有关系，分泌物会随植物种类的不同而存在差异。根系分泌物是植物作用于湿地微环境的重要途径之一（夏北成等，1998），植物通过根系分泌物的释放来改变根际微生物群落结构。土壤环境受到植物生长的影响，使得土壤微生物群落的结构和多样性发生改变，受植被影响的土壤环境中土壤微生物群落多样性比其他未受植被影响土壤环境中的微生物群落多样性要高很多。

对这32株细菌进行抑菌活性研究，发现有8株细菌对马尔尼菲青霉菌有抑制作用，总阳性率为25.0%；其中，有3株细菌表现出极强的抑菌活性。该3株细菌为BGMRC 2015、BGMRC 2059和BGMRC 2043，分别与Bacillus vietnamensis 15-1T、Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42T和Pseudomonas mosselii CIP 105259T相似性最高。其中，BGMRC2043的MIC50为（1.604±0.021）mg·mL-1。多种芽孢杆菌属的细菌通过竞争营养空间、产生脂肽类抗生素、诱导植物系统抗性等，具有抗菌、抗肿瘤和抗炎症等生物活性（唐金山等，2008）。对于菌株P. mosselii CIP 105259T，Nishanth et al（2016）系统地进行了该菌代谢产物的活性实验分析，其代谢产物中有活性小分子Pseudopyronine B，具有很好的抑制革兰氏阳性细菌、抗植物病原真菌、抑制细胞增长及抗癌等活性。本研究发现，P. mosselii CIP 105259T对马尔尼菲青霉菌也具有极强的抑制活性，本研究丰富对P. mosselii CIP 105259T菌株抑菌活性的认识，也为开发新的抗生素及活性药物等下游工作提供很好的依据。

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