龙须藤叶粗提物的分离纯化及生物活性初探

姚宗理　吴清来　 柯健　黄冠　杜晓英　李俊凯

摘要： 為进一步研究和开发新植物源农药，拓宽龙须藤（Bauhinia championii）的生物活性研究，探索其不同组分潜在的杀菌和除草活性，该研究通过常温冷浸提取法提取、真空浓缩得到甲醇提取物。结果表明：用硅胶柱层析分离纯化，经TLC检识和碘缸显色后整合得到9个组分。反复重结晶7号和8号组分中析出的物质，经TLC检识和测熔点，得到1个纯化合物，编为33号，经波谱数据分析与molbase库对照，鉴定该化合物为（1R， 2S， 3S， 4S， 5S， 6S）-6-甲氧基-1， 2， 3， 4， 5-环己烷五醇，是一种重要的工业原料。杀菌和除草活性试验结果显示，粗提物在1 000 μg·mL-1时对水稻稻瘟病菌的抑制率为（40.84±1.00）%，对稗草根的抑制率为（49.18±2.33）%；各组分在500 μg·mL-1时，4号组分对水稻稻瘟病菌的抑制率达到（44.19±0.76）%， 2号和3号组分对稗草根的抑制率分别为（88.92±1.31）%和（90.99±1.45）%，3号和6号组分对马齿苋根的抑制率分别为（72.06±1.31）%和（89.92±1.73）%。这表明龙须藤叶提取物对水稻稻瘟病菌、稗草根和马齿苋根有良好的抑制效果，可进一步分离2号、3号、4号、6号组分，以获得高活性的单体化合物。

关键词： 龙须藤， 生物活性， 甲醇提取物， 分离纯化， 单体化合物

中图分类号： Q946， O629.2， S482.4文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2018）07-0886-08

Abstract： Bauhinia championii， a traditional Chinese herbal medicine， has effects on anti-inflammatory， analgesic， eliminate free radicals， anti-bacterial， anti-tumor and so on. In order to further broaden the potential fungicidal and herbicidal activities of different constituents of B. championii， we attempted to dry and smash B. championii leaves and used methanol to extract for three times at the normal temperature. Crude extract was separated and purified on silica gel column chromatography. A bottle of fraction was collected every 200 mL， according to TLC detection and iodine cylinder integration， the crude extract was separated into nine constituents. The precipitated material in constituents No. 7 and No. 8 were recrystallized repeatedly， and melting points were confirmed and measured by pointing GF254 silica gel plate. One pure compound was obtained and named No. 33. Based on data analysis and compared with molbase library， this compound was identified as 1-D-4-O-methyl-myo-insitol， an important industrial raw material. The test results of fungicidal and herbicidal activities showed the crude extract of B. championii leaves to inhibition rate of Pyricularia oryae was （40.84±1.00）% at 1 000 μg·mL-1 ， and inhibition rate of Echinochloa crusgalli roots was （49.18±2.33）%. When the constituents were at 500 μg·mL-1， No. 4 constituent of Pyricularia oryae inhibition rate reached （44.19±0.76）%， inhibition rate of No. 2 and No. 3 constituents on Echinochloa crusgalli roots were （88.92±1.31）% and （90.99±1.45）%， respectively； inhibition rate of No. 3 and No. 6 constituents on Portulaca oleracea roots were （72.06±1.31）% and （89.92±1.73）%， respectively. The results indicate that the extract of Bauhinia championii leaves have a certain amount of inhibitory effects on Pyricularia oryae， Echinochloa crusgalli roots and Portulaca oleracea roots. In order to acquire high activity monomer compounds， the constituents of No. 2， No. 3， No. 4 and No. 6 can be further separated.

Key words： Bauhinia championii， biological activity， methanol extracts， separation and purification， monomer compounds

龙须藤（Bauhinia championii）又称九龙藤、梅花入骨丹、羊蹄藤、乌郎藤、过岗圆龙等，系双子叶植物豆科羊蹄甲属植物多年生藤（封锡志等，2000），分布于广东、湖南、湖北、江西、福建、浙江、贵州、广西等地，生长于海拔200～1 000 m的地區（全国中草药汇编编写组，1996），含黄酮类（Frances & Margaret， 1969； Vecchietti et al， 1979； Nonaka et al ，1982； Chen et al， 1984； 张玉琴等，2013）、芳香酸类（白海云等，2004）、黄烷醇类（徐伟等，2009）、甾醇类（Peng & Chen，2001； 白海云等，2005； 徐伟等，2013）、萜类（叶蕻芝等，2009）、糖类（汪艳娟等，2001； 蔡亮亮，2013）等，具有抗细菌（洪振丰等，2007）、抗炎镇痛（易荆丽等，2012； Xu et al， 2013； Cai et al， 2013； 林丽微等，2014）、抗肿瘤（叶蕻芝等，2011）、消除自由基（高杰等，2011； 林炜鑫，2013）、抗血小板凝集（胡娟等，2007）、治疗类风湿性关节炎（窦锡彬等，2006； 王柏灿，2008； 庞宇舟等，2013）、祛风除湿（江苏新医学院，1986）、治疗胃脘痛（黄耀奎等，2005）等功效，可用于治疗肠胃疾病（郭超勤和相鲁闽，2001）、风湿性关节炎和慢性腰腿痛（方鼎，1985；魏衡生和祁芝云，1998； 黄兆胜，2003）等，是一种重要的中药材，但龙须藤周围极少有真菌和杂草生长，笔者推测可能在龙须藤中还有抑制真菌和杂草生长的活性化合物。因此，本课题组对龙须藤的甲醇提取物进行初步的分离纯化、结构鉴定和生物活性测定，初步确定龙须藤叶具有一定的杀菌和除草活性。

1材料与方法

1.1 供试材料、试剂和仪器

1.1.1 供试材料龙须藤叶，于2017年2月采自广西贺州市信都镇联盟村民黎山西北坡，由中科院武汉植物园江明喜研究员鉴定为豆科羊蹄甲属植物龙须藤（Bauhinia championii）。

1.1.2 供试菌种和杂草种子水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryae）等病原菌和油菜种子（Brassica napus seed）、稗草种子（Echinochloa crusgalli seed）、马齿苋种子（Portulaca oleracea seed）等供试植物种子由长江大学农学院植物保护教研组提供。

1.1.3 供试试剂甲醇（AR）、吐温-80（CP）、石油醚（AR）、氯仿（AR）、乙酸乙酯（AR）、 N，N-二甲基甲酰胺（DMF，AR）、丙酮（AR），均为市售商品。

1.1.4 主要仪器200～300目硅胶（青岛谱科分离材料有限公司）；FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；DLF-18型流水式中药粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；A-1000S型水流抽气机（上海爱朗仪器有限公司）；ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；ES-315型高压灭菌锅（TOMY KOGYO CO.，LTD）；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；QT型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）； DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SPX-250型生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；BIC-400型人工气候箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；Yanagimoto MFG.熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司，温度计未校正）；核磁共振仪（Bruker Avance DPX400，Bruker公司）；傅立叶变换高分辨质谱仪（Bruker APEX IV，Bruker公司）。

1.2方法

1.2.1 粗提物的制备参考凌冰等（2008），在室温下，将阴干的龙须藤叶片用流水式中药粉碎机粉碎，过60目标准筛，取300.00 g过筛的叶片粉末用95%甲醇常温浸提3次，料液比为1∶10，浸提时间依次为5、3、1 d， 合并提取液，用旋转蒸发仪50 ℃减压浓缩，回收甲醇，获得甲醇粗提物浸膏。

1.2.2 分离纯化取粗提物50.00 g，用少量甲醇热熔后，与50.00 g硅胶（200～300目）充分拌匀、晾干，装入硅胶层析柱（6.00 cm×80.00 cm，200～300目硅胶400.00 g），依次用乙酸乙酯∶石油醚（0∶1～1∶0）、100%乙酸乙酯、氯仿∶甲醇（0∶1～1∶0）和100%甲醇进行梯度洗脱，各梯度溶剂为3 000 mL，每200 mL为1个组分收集洗脱液， 50 ℃减压浓缩，GF254薄层层析硅胶板展开， 254 nm紫外荧光仪下检识或碘缸显色，合并Rf值相同的组分，获得9个组分。对7号和8号组分中析出的物质，用少量甲醇热熔，反复重结晶，TLC检识整合和熔点测定，获取纯化合物，标记33号。

1.2.3 药液的配置分别称取0.50 g龙须藤叶粗提物和0.25 g各组分于15 mL棕色样品瓶中，用丙酮并用超声波清洗器助溶，在超净工作台中用含0.1%吐温-80的无菌去离子水定容至50 mL，粗提物配成10 000 μg·mL-1溶液，各组分配成5 000 μg·mL-1溶液，用于杀菌和除草活性测定。

1.2.4 杀菌活性试验采用离体平皿培养法（陈小霞等，2007），用PDA培养基，以供试病原菌为对象，对所浸提的粗提物进行杀菌活性测定，培养基中供试提取物组分浓度为1 000 μg·mL-1。接上病原菌菌饼后于28 ℃生化培养箱中培养，同时以等量的丙酮和含0.1%吐温-80的无菌去离子水作为对照，每处理重复3次。当对照组的菌落长至培养皿底部3/4面积时用十字交叉法（张建宁，2015）测量菌落直径，通过以下公式计算抑制率。

对照组菌落生长直径-处理组菌落生长直径对照组菌落生长直径

1.2.5 除草活性试验用种子生物测定法（徐江艳，2013），将供试种子催芽后挑选发芽势相同的种子放于铺有中速滤纸的90 mm 培养皿内，每皿15粒，每皿加药液5 mL。以等量的丙酮和含0.1%吐温-80的无菌去离子水作为对照，每处理重复3次，置于人工气候箱内培养，设置温度28 ℃，湿度80%，光照度1 100 lx，光照时间为14 h·d-1，培养4～5 d后测量根长和芽长，计算相对抑制率。

2结果与分析

2.1 粗提物的提取率与分离纯化

采用上述提取方法，300.00 g龙须藤叶浸提得到85.73 g膏状物，提取率为28.58%。根据文献报道（马力，2010），影响提取率的因素可能与溶剂浓度、提取时间、提取次数、提取温度及植物生长时期有关。50.00 g经硅胶柱层析分离后共回收样品30.71 g，回收率61.42%，结果见表1。影响回收率的因素可能跟层析柱的种类、样品的极性、过柱时间有关。

2.2 纯化合物结构鉴定

经过反复重结晶，获得的化合物的波谱数据如下：

化合物33白色固体；mp 182.5～183.3 ℃； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d）： δ 9.01 （s， 1H）， 7.94 （d， J = 9.6 Hz， 2H）， 7.14 （d， J = 16.8 Hz， 2H）， 6.32 （d， J = 9.6 Hz， 2H）， 5.39 （s， 1H）， 5.15 （dd， J = 4.4， 5.2 Hz， 2H）， 4.93 （d， J = 7.2 Hz， 1H）， 4.67（t = 10.8 Hz， 1H），3.76～3.73（m， 1H）， 3.50～3.44（m， 1H）. 13CNMR （400 MHz， DMSO-d）： 84.24， 73.04， 72.86， 72.41， 71.34， 70.52， 60.13. HRMS計算值 C7H14O6， [M-H]-：193.071 6， 实测值193.071 8。经波谱数据分析与molbase库对照，鉴定该化合物为（1R， 2S， 3S， 4S， 5S， 6S）-6-甲氧基-1， 2， 3， 4， 5-环己烷五醇。该化合物为工业重要原料。

2.3 杀菌活性试验结果

测定了甲醇粗提物（1 000 μg·mL-1）、化合物33（500 μg·mL-1）以及9个柱层析组分（500 μg·mL-1）对供试病原菌的生物活性，结果见表2。表2结果表明，龙须藤粗提物对部分供试病原菌有一定的抑制效果，对水稻稻瘟病菌的抑制效果最佳，抑制率达到（40.84±1.00）%；将提取物按照极性从小到大分成的9个组分中，4号组分对所有的供试病原菌都有一定的抑制活性，对水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌的抑制效果最佳，分别达到（36.26±0.76）%和（44.19±0.76）%，可初步确定有杀菌活性的成分集中在该组分。

2.4 除草活性试验结果

用种子生物测定法将供试种子催芽后挑选发芽势相同的种子进行除草活性测定，测量其根、芽生长指标，计算相对抑制率，结果列于表3。结果表明，龙须藤粗提物对所有供试种子根长都有抑制效果，对稗草根的抑制效果最佳，抑制率达到（49.18±2.33）%， 2号和3号组分对稗草根的抑制效果最好，抑制率分别达到（88.92±1.31）%和（90.99±1.45）%；3号和6号组分对马齿苋根抑制效果最好，抑制率分别达到（72.06±1.31）% 和（89.92±1.73）%。可初步确定具有除草活性的成分主要集中在2号、3号和6号组分中。

3讨论与结论

龙须藤具有广泛的医药活性，目前主要集中在抗细菌（洪振丰等，2007）、抗炎镇痛（易荆丽等，2012； Xu et al， 2013； Cai et al， 2013； 林丽微等，2014）、抗肿瘤（叶蕻芝等，2011）、消除自由基（高杰等，2011； 林炜鑫，2013）和抗凝血（夏俊伟等，2016）等方面研究，在抗真菌和除草活性方面的研究却鲜有报道。本研究首次对龙须藤叶粗提物进行常见作物病原真菌和除草活性测定，结果表明龙须藤叶粗提物对水稻稻瘟病菌菌丝生长和稗草萌芽都具有良好的抑制效果。为进一步锁定粗提物的活性成分，对龙须藤叶粗提物进行了柱层析分离纯化，根据洗脱溶剂极性分段收集，经TLC检识和碘缸显色熏蒸后整合得到9个组分和1个纯化合物，经波谱数据分析与molbase库对照，鉴定该化合物为（1R，2S，3S，4S，5S，6S）-6-甲氧基-1，2，3，4，5-环己烷五醇，该化合物是一种重要的工业原料。通过对分段收集的9个组分抗真菌和除草活性测定，结果表明所有组分均具有杀菌活性，其中 4号组分对水稻稻瘟病菌的抑制效果最好，说明具有最佳杀菌活性的化合物集中在该组分，推测该化合物对水稻稻瘟病菌所在属的其他致病菌可能也有相当的抑制作用，有待进一步研究。2号和3号组分对稗草根的抑制效果最好，具有开发成针对单子叶杂草除草剂的潜能；3号组分对马齿苋根同样表现出良好的抑制效果，说明3号组分对单子叶植物和双子叶植物杂草均具有良好的抑制效果，具有开发成广谱性除草剂的潜能；6号组分对马齿苋根的抑制效果最好，具有开发成针对双子叶杂草除草剂的潜能。

本研究初步锁定了高活性化合物所在组分，结果表明龙须藤叶提取物对水稻稻瘟病菌、稗草根和马齿苋根有良好的抑制效果，后期工作可对2号、3号、4号和6号三个组分进一步分离纯化，并通过结构鉴定和生物活性测定获得高活性的单体化合物，研究结果可为龙须藤作为新植物源农药的进一步研究与开发奠定基础。

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