莪术醇诱导人肝癌HepG2细胞衰老及其机制研究

黄岚珍　杨飞城　阳晶　蒋晓山

摘要： 为进一步探讨莪术醇的诱导细胞衰老的机制，该研究采用荧光定量PCR技术对莪术醇处理后细胞中 81 个细胞衰老相关基因差异表达谱进行分析，结果发现TP53及其下游基因p16Ink4a、p21Waf1/Cip1和p27Kip1等的表达水平显著升高，伴随ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等多个衰老信号通路启动与效应关联基因的转录显著增强，而Cyclin A2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等细胞周期进程与衰老信号通路的负性调控基因的表达水平则显著降低。Western印迹检测结果显示，p53及其下游周期素依赖性蛋白激酶抑制物（CKI）分子p21WAF1和p16INK4水平升高，Cyclin A2水平降低，与PCR结果一致，并伴野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1（Wip1）水平显著增高，提示莪术醇可能通过激活p53信号通路诱导HepG2细胞衰老。该研究进一步发现莪术醇能够诱导HepG2细胞发生衰老表型改变，伴G0/G1期周期阻滞。

关键词： 莪术醇， 肿瘤细胞早衰， HepG2细胞， 肝癌， 细胞周期阻滞

中图分类号： Q946文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2018）07-0894-09

Abstract： In order to further study the antitumor mechanism of curcumol and its potential clinical application， a SYBR Green real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） method was used to analyze the differential expression profiles of 81 human senescence-related genes in human hepatocarcinoma HepG2 cells treated with curcumol. The results showed that the expression of TP53 and its downstream genes p16Ink4a， p21Waf1 / Cip1 and p27Kip1 were significantly up-regulated， accompanied by transactivation of other senescence signaling pathway related genes or senescence response genes such as ABL1， ALDH1A3， CHEK2， HRAS， PTEN， etc.， while the expression of Cyclin A2， IGFBP3， SIRT1 and TERT， the genes which negatively regulated cell cycle progression and senescence signaling， were significantly down-regulated. Western blotting verified that protein levels of p53 and its downstream CKIs， p21WAF1 and p16INK4 increased while Cyclin A2 decreased， consistent with the findings in PCR results. The level of wild-type p53-induced protein phosphatase 1 （Wip1） was also found significantly increased， suggesting that the induction of senescence in HepG2 cells by curcumol might be through activation of p53 signaling pathway. The present study further demonstrates that curcumol is capable of inducing cellular senescent phenotype in HepG2， accompanying with cell cycle G0 / G1 phase arrest.

Key words： curcumol， premature senescence of tumor cells， HepG2 cells， liver cancer， cell cycle arrest

细胞衰老是指细胞从活跃增殖进入生长停滞状态的不可逆轉过程。衰老的细胞仍具有基本的代谢活动，但失去了DNA合成能力和对有丝分裂原刺激反应，细胞脂褐素沉积增加、体积变大扁平、细胞器变形、膜脆性增加、核膜内陷、表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。过去，因其无限制增殖的特性，肿瘤细胞被认为失去了衰老的能力。近十多年来，研究发现肿瘤细胞在小剂量的化疗药物处理或射线照射等一定条件下可以被诱导进入衰老状态，这种诱导性衰老有别于复制性衰老，被称为早熟衰老（早衰）（premature/accelerated senescence）（Nardella et al，2011）。寻找诱导肿瘤细胞进入衰老状态的药物或分子靶点，以恢复与激活肿瘤细胞的衰老通路作为肿瘤治疗新策略的研究日益受到重视（Nardella et al，2011；Schosserer et al， 2017）。

莪术醇（C15H24O2，Curcumol），又名姜黄环奥醇，是自中药莪术中分离得到的单体化合物，对多种人肿瘤细胞增殖具有抑制作用（王耀霞和徐立春，2009； Lu et al， 2012； Huang et al，2017）。我们曾经报道，莪术醇能够抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并显著影响细胞周期及其相关调控基因的表达（黄岚珍等，2013）。本研究进一步发现，较低剂量莪术醇能够诱导HepG2细胞发生衰老表型改变，并对 81 个细胞衰老相关基因差异表达谱及主要启动调控分子表达水平进行了初步观察，为进一步探讨莪术醇抗肿瘤作用机制及其潜在的临床应用提供了有价值的信息。

1材料

1.1 主要试剂与仪器

试剂：莪术醇（纯度≥98%，上海艾汇生物科技公司，生产批号 P02-03）50 mg·mL-1溶于无水乙醇贮存；碘化丙啶（PI） （Sigma）；二甲基亚砜（DMSO） （美国Sigma）；四氮唑蓝（MTT） （美国Amresco）；兔抗人 p53多抗及鼠抗人 p16、Wip1、p21及 β-actin 单抗（美国Santa Cruz）。仪器：FACSAriaⅢ流式细胞仪（美国BD）；iMark 型酶标仪（美国Bio-Rad）；CO2 细胞培养箱（美国NBS）。

1.2 细胞株与细胞培养

人肝癌細胞株HepG2购自中国科学院细胞所（上海）细胞库，常规培养于10%胎牛血清（美国HyClone）的DMEM培养基（美国HyClone）含5%CO2的37 ℃培养箱中，每 3～4 d 换液传代。

2方法

2.1 MTT 比色法检测细胞增殖

将人肝癌HepG2细胞以每孔4×103个接种于 96 孔板，培养过夜。更换成含不同浓度莪术醇的培养液[均含等体积乙醇（vehicle）]每孔100 μL，于预定时间每孔加入MTT 10 μL，37 ℃孵育 4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL，避光振荡 20 min，酶标仪测定OD490 值（A），实验重复 3 次。细胞生长抑制率计算：抑制率（%）= [1-（A 实验组/A对照组）]×100。IC50值由SPSS （version 20.0）软件计算得出。

2.2 流式细胞术检测细胞周期

HepG2细胞于无血清DMEM培养基培养 5 d，使大部分细胞停留在G1期。取经细胞周期同步化的细胞，以 每个皿5×105 个接种于 Ф 60 mm 培养皿中，20 h 后更换成含不同浓度莪术醇的培养液（均含等体积乙醇）；分别于 16、24、32 h常规消化收集细胞，70% 乙醇固定， 1% RNA酶处理、PI染色，流式细胞仪检测细胞周期分布（DNA 含量）情况。实验重复 3 次。

2.3 细胞衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性检测

细胞种于 6 孔板，莪术醇处理24 h，分别于第 7天和第10 天弃培养液。先用PBS洗 1 次， 用0.2% 戊二醛固定 5 min；再用PBS洗 3 次，加入X-gal染液[150 mmol·L-1 NaCl，1 mg·mL-1 X-gal， 5 mmol·L-1 K3Fe（CN）6，2 mmol·L-1 MgCl2， 40 mmol·L-1 NaPi， pH 6.0，5 mmol·L-1 K4Fe（CN）6]，37 ℃孵育 6～24 h。在显微镜下，随机视野计数蓝染的阳性细胞。

2.4 实时荧光定量 PCR 检测细胞周期调控相关基因的表达

委托美国Invitrogen （上海）公司参照SABiosciences公司人类细胞衰老相关基因的 PCR 阵列中的 84 个基因名录（http：//www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/HTML/PAHS-050Z.html），设计、合成基因特异的定量PCR引物。实时荧光定量 PCR（SYBR Green染料法）检测基因表达水平，参考杨飞城等（2015）的方法，结果根据标准曲线由软件自动计算后得出，共 82 个基因获得有效扩增（基因名称与引物序列见表1），GAPDH和ACTB基因用于扩增内参及定量标化。

2.5 Western 印迹

收集细胞，RIPA裂解缓冲液 （0.5% 脱氧胆酸钠，1.0% NP-40，150 mmol·L-1 氯化纳， 0.1% SDS，50 mmol·L-1 Tris-pH 8.0， 0.2 mg·L-1 抑肽酶，1 mmol·L-1 苯甲基磺酰氟， 0.5 mg·L-1 亮抑蛋白肽酶）冰上裂解， 离心取上清；加入上样缓冲液， 煮沸 5 min， 经SDS-PAGE电泳后半干电转法转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭 1 h ，一抗4 ℃ 过夜孵育，TBS-T 洗 3 次，HRP标记的相应二抗室温孵育 1 h，ECL化学发光法检测特异蛋白条带。

2.6 统计学分析

应用 SPSS 20.0 统计软件，重复测量资料方差分析，样本两两比较进行 LSD-t 检验。

3结果与分析

3.1 莪术醇对HepG2细胞增殖及细胞周期的影响

用不同浓度（0～1 000.0 mg·L-1）的莪术醇分别处理人肝癌HepG2细胞 48 h 及 72 h，用MTT法检测细胞活力并计算莪术醇的IC50。如图1：A所示，莪术醇对HepG2细胞增殖活性具有显著抑制作用，呈时间和剂量依赖性，48 h 及 72 h 的IC50分别为529.5 mg·L-1 和 173.5 mg·L-1。 为进一步观察莪术醇对HepG2细胞增殖的长时间影响，先以无血清培养液同步化HepG2细胞，然后采用 25 mg·L-1 莪术醇处理 24 h，更换不含莪术醇的培养基并于第3天细胞长至 80% 融合时稀释（1∶4）传代。分别收集经莪术醇处理 24、72及 120 h 的细胞，乙醇固定、 碘化丙啶（PI ）染色上流式细胞仪检测细胞周期分布情况，结果见图1：B和图1：C。与对照组相比，莪术醇处理 24 h 和 72 h 后G0/G1期细胞分别由 （62.88 ± 4.71）% 和 （66.13 ± 0.83）% 增加到 （69.17 ± 4.44）% 和 （84.31 ± 2.15）%，而S期和G2期细胞相应减少，在处理后 120 h 时G1/G0期细胞仍高达 （85.74 ± 5.30）%，对照组为 （65.76 ± 1.52）%，差异有统计学意义，提示较低剂量莪术醇能够诱导HepG2细胞长时间的G0/G1期阻滞。

3.2 莪术醇对HepG2细胞的衰老诱导作用

长时间细胞周期阻滞可能是细胞的衰老反应。衰老细胞体积变大扁平，核膜内陷，细胞器变形，衰老相关的β-半乳糖苷酶 （SA-β-gal）染色阳性。为检测莪术醇处理后HepG2细胞是否发生衰老表型改变，在前述3.1 细胞周期实验的基础上，对莪术醇（25 mg·L-1）处理后的HepG2细胞分别于第7天和第10天进行SA-β-gal染色，光镜下观察细胞形态并计数蓝染阳性细胞，见莪术醇处理后细胞呈现大而扁平的改变，7 d和10 d组蓝染细胞数分别为（70.03±8.37）% 和 （87.23±6.89）%； 空白对照组细胞形态无明显变化，细胞SA-β-gal检测蓝染率为（2.28 ± 0.73）%～（4.40 ± 1.26）%， 兩组间差异检验有统计学意义（P<0.01， 图2）。

3.3 莪术醇对 HepG2 细胞衰老相关基因表达谱的影响

为进一步探讨莪术醇诱导细胞衰老的机制，我们采用SYBR Green实时荧光定量RT-PCR方法筛查莪术醇处理后HepG2细胞中81个衰老相关基因差异表达情况并以ACTB基因标化定量分析。结果显示， 与对照组（vehicle处理）比较，25 mg·L-1 莪术醇处理 24 h 后，HepG2细胞中 20 个基因：ABL1、ALDH1A3、ATM、B2M、CALR、Cyclin D1、CD44、CDK2、p21-Cip1、p27-Kip1、p16-Ink4a、p19-Ink4D、TP53、COL3A1、ETS1、HRAS、IFNG、PRLP0、PTEN，表达水平显著上调；8 个基因：Cyclin A2、GADD45A、HPRT1、IGFBP3、MORC3、SIRT1、TERT、THBS1，表达水平显著下调（图3，表2）。

3.4 Western 印迹检测p53蛋白功能

采用 Western 印迹技术对p53及其下游主要周期素依赖性蛋白激酶抑制物（CKIs）分子的表达水平进行验证。结果显示，经莪术醇处理，HepG2细胞的p53、p21WAF1和p16INK4蛋白水平较对照组显著升高，Cyclin A2水平显著降低，与前述PCR实验检测该基因mRNA水平下调的结果一致。此外，检测发现野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1（Wip1）水平显著增高，结合p21WAF1的转录激活，表明p53功能被激活，（图4）。

4讨论与结论

莪术醇是从中药莪术中分离得到的单体化合物，广西是我国莪术的主产区之一。体外细胞培养和动物实验表明，莪术醇能够抑制肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌等多种肿瘤细胞的增殖与生长，其作用机理可能涉及诱导细胞周期阻滞与凋亡、 抑制细胞核酸代谢、 抑制肿瘤血管生成、 促进注： A. 莪术醇处理HepG2细胞后第7天和第10天分别行衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，光镜下观察细胞形态变化及胞浆蓝染 （×400）； B. 三次独立SA-β-gal染色实验蓝染阳性细胞百分数的均值±标准差的细胞分化等诸多方面 （王耀霞和徐立春， 2009； Tang et al， 2015），目前对于莪术醇抗肿瘤的作用机理还缺乏深入研究。我们曾经报道，莪术醇对人肝癌HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用，该效应呈时间和剂量依赖性，与激活p53/pRB通路，抑制Cyclin A基因表达和上调p21WAF1、p27KIP1、CDK8等基因水平有关（黄岚珍等， 2013）。此外，莪术醇还能够通过激活p73-PUMA信号通路，诱导p53突变型三阴性乳腺癌MDA-MB 231细胞凋亡（Huang et al， 2017）。在本研究中，我们发现较低剂量（25 mg·L-1）莪术醇处理HepG2细胞，诱导G0/G1期周期阻滞，伴细胞体积变大扁平、表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶等细胞衰老表型改变，表明莪术醇具有诱导HepG2细胞早衰的生物学效应。

衰老细胞表现为不可逆地细胞周期停滞特征。在哺乳动物中，细胞周期进程存在G1/S期、G2/M期及纺锤体装配期3个检查点（check point） ，受到周期素（cyclins）、周期素依赖性蛋白激酶（CDK）和周期素依赖性蛋白激酶抑制物（CKI）的严格调控。CDK通过与相应Cyclin形成复合物而被激活，驱动细胞周期进程。如Cyclin A1可与CDK2结合形成复合物，敲除Cyclin A1基因导致G1期细胞周期阻滞，Cyclin A2则可以在S期结合CDK1或CDK2参与G2/M期转换的调控（Pagano et al， 1992）。Wu et al（2009）研究发现，植物娃儿藤提取物Tylophorine通过抑制Cyclin A2基因水平诱导HepG2细胞G0/G1期周期阻滞，而Cyclin A2基因过表达则能够逆转Tylophorine诱导的这一周期阻滞效应。另一方面，Cyclin-CDK复合物的作用受CKI直接控制。CKI分为INK4和CIP / KIP家族两类。前者主要通过隔离CDK，阻止CDK与Cyclin形成复合物；后者则可以直接与Cyclin-CDK复合物结合，通过抑制CDK的活性对细胞周期进程负向调节。本研究采用高通量荧光定量PCR技术对莪术醇处理后的HepG2细胞中 81 个衰老相关基因进行了差异表达谱分析，结果表明TP53及其下游基因p16 Ink4a、p21 Waf1/Cip1和p27 Kip1等的表达水平显著升高，伴随ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等衰老信号通路启动与效应关联基因的转录显著增强，而Cyclin A2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等细胞周期进程与衰老信号通路的负性调控基因的表达水平则显著降低。通常认为，当细胞内DNA受损时，p53即被激活，通过p21或/和p27抑制CDK2和CDK3活性，或激活p16以阻断CDK4和CDK6与Cyclin的结合，抑制RB信号通路，阻滞细胞周期于G1/G0期或G2/M期（Terzi et al， 2016； Gire & Dulic，2015）。衰老相关基因表达谱筛查结果发现共计20个基因mRNA水平上调、8个基因水平下调，提示莪术醇诱导细胞衰老涉及复杂的信号转导机制。本研究中Western blot检测结果除证实细胞p16水平升高和Cyclin A2水平降低以外，还显示p53蛋白及其转录激活靶分子p21WAF1和野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1（Wip1）的水平显著增高，提示p53激活可能是莪术醇诱导HepG2细胞衰老的重要原因，值得探讨。

本研究表明，莪术醇能够在体外诱导肝癌HepG2细胞早衰，其机制可能是通过活化抑癌基因p53，上调p21WAF1、p16INK4等CKI分子及PTEN的表达水平，一系列涉及衰老通路关联分子参与，从而诱导细胞周期G0/G1期阻滞来实现的。本研究为进一步探讨莪术醇的抗肿瘤作用机制及其潜在的临床应用提供了有价值的信息。

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